目的 建立测定去水卫矛醇含量的柱前衍生化反相高效液相色谱法(RP-HPLC)。方法 去水卫矛醇经二乙基二硫代氨基甲酸钠衍生化后进行RP-HPLC分析,采用Welch Ultimate XB-CN色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈-水(50:50),流速为 1.0 mL∙min-1,检测波长为 278 nm。结果 40 ℃下衍生化反应可在30 min内完成,去水卫矛醇衍生物在10 h内稳定。去水卫矛醇在0.100~20.0 μg∙mL-1范围内线性关系良好(
Objective To establish a reversed-phase high performance liquid chromatographic (RP-HPLC) method with pre-column derivatization for determination of dianhydrogalactitol. Methods After dianhydrogalactitol was derivatized with sodium diethyldithiocarbamate, the RP-HPLC separation was performed on a Welch Ultimate XB-CN column (250 mm×4.6 mm,5 μm) with the mixture of acetonitrile-water (50:50) as the mobile phase. The flow rate was 1.0 mL∙min-1 and the detection wavelength was set at 278 nm. Results The derivatization reaction could be finished within 30 min at 40 ℃ and the derivative was stable within 10 h. The calibration curve was linear over the range of 0.100-20.0 μg·mL-1 (
鉴于良好的临床应用前景,去水卫矛醇的新药开发和质量控制显得尤为重要。该品种原料[10]及制剂[11]的国家标准均采用滴定分析法测定含量,虽简便易行,但专属性较差。魏宁漪等[12]采用气相色谱(GC)法测定注射用去水卫矛醇的含量,但笔者在重现实验时发现药物在气化过程中存在降解的风险。吴先富等[13]采用磁共振法测定去水卫矛醇原料含量,但该法对仪器要求较高,应用受到较大限制。高效液相色谱法(HPLC)具有分析速度快、灵敏度高、专属性强的优点,是目前药品质量控制中最常用的方法之一。去水卫矛醇的化学结构式中缺乏生色团,无法采用紫外检测器测定其有关物质和含量,因此考虑采用柱前衍生化的方法改善其紫外吸收特性。二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDTC)是一种便宜易得的衍生化试剂,可与环氧基反应生成稳定的具有紫外吸收的产物。笔者采用DDTC作为柱前衍生化试剂,选择使用广泛的紫外检测器,探索建立测定去水卫矛醇含量的衍生化反相HPLC法,并利用液相色谱-串联质谱联用技术(LC-MS/MS)对衍生物进行结构确认。
日本岛津高效液相色谱仪(含二元高压输液泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器及Labsolution工作站);安捷伦6420 HPLC-MS/MS三重四级杆液质联用系统(含安捷伦1260 Infinity高效液相色谱仪、自动进样器、电喷雾离子化接口、四级杆质谱检测器、MassHunter数据分析处理软件);BT25-S型电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司,感量:0.01 mg);XW-80A旋涡混合器(上海医大仪器有限公司);HH-W三用恒温水箱(常州市国立试验设备研究所);Mini-14K微型高速离心机(杭州奥盛仪器有限公司);ZLS-1真空离心浓缩仪(湖南赫西仪器装备有限公司)。
去水卫矛醇原料(批号170601)和对照品由广西梧州制药(集团)股份有限公司提供。乙腈(色谱纯,美国天地公司);DDTC(分析纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);实验用水为去离子纯化水;其余试剂均为分析纯。
色谱柱为Welch Ultimate XB-CN(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈-水(50:50),流速为1.0 mL∙min-1,柱温为30 ℃,检测波长为278 nm,进样量为20 μL。
电喷雾离子源,正离子检测模式,离子扫描范围
2.3.1 供试品溶液和对照品溶液 取去水卫矛醇原料和对照品10 mg,精密称定,分别置100 mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取1 mL,置10 mL量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液和对照品溶液。
2.3.2 衍生化试剂溶液 精密称取DDTC适量,加水溶解并定量稀释制得浓度为5 %的衍生化试剂溶液。
2.3.3 磷酸盐缓冲液(pH 值7.0) 取三水合磷酸氢二钾约0.439 g及磷酸二氢钾0.419 g,精密称定,置50 mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀。
精密量取去水卫矛醇对照品溶液和供试品溶液各400 μL,依次精密加入磷酸盐缓冲液(pH值7.0)400 μL和衍生化试剂溶液200 μL,涡旋30 s,40 ℃水浴反应30 min后,冰水浴5 min终止反应。精密加入乙酸乙酯2 mL,涡旋3 min萃取衍生物,离心5 min,精密量取上清液1.8 mL,用氮气吹干后,精密加入流动相800 μL复溶,进行HPLC分析。
2.5.1 色谱柱的选择 笔者在本实验比较了Hypersil-CN(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Ultimate XB-CN(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)和Hedera ODS-2(250 mm×4.6 mm,5 μm)等不同品牌及填料的色谱柱对分析的影响,发现在Welch Ultimate XB-CN色谱柱上,分析物峰形对称且保留时间合适。
2.5.2 检测波长的选择 精密量取去水卫矛醇对照品溶液适量,按“2.4”项处理后,用流动相溶解并稀释制成适宜浓度的溶液,于200~350 nm波长范围内扫描紫外吸收光谱图(
2.5.3 流动相的选择 实验考察了甲醇-水和乙腈-水系统,发现采用乙腈-水系统作为流动相时,基线稳定且峰形尖锐,经系统摸索,最终确定流动相为乙腈-水(50:50,
取去水卫矛醇对照品溶液,按“2.4”项处理后,进行LC-ESI-MS/MS分析,特征碎片离子以及质谱裂解规律见
2.7.1 专属性实验 空白干扰实验:分别取空白溶剂、去水卫矛醇对照品溶液和供试品溶液,按“2.4”项操作后,进行HPLC分析,典型的色谱图见
强制降解研究:取去水卫矛醇10 mg,精密称定,置100 mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取1 mL,置10 mL量瓶中,分别进行酸破坏(0.1 mol·L-1盐酸溶液1 mL,室温2 h)、碱破坏(0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液1 mL,室温2 h)、氧化破坏(3%过氧化氢溶液1 mL,室温1 h)、高温破坏(60 ℃ 2 h)和光照破坏(紫外灯下2 h),用水稀释至刻度,摇匀,按“2.4”项处理后,进行HPLC分析,典型色谱图见
2.7.2 检测限及定量限 精密称取对照品适量,用水溶解并定量稀释制成不同浓度的溶液,衍生化处理后进行HPLC分析,去水卫矛醇检测限(
2.7.3 线性关系考察 精密称取对照品适量,加水溶解并定量稀释制成浓度分别为0.100,0.500,1.00,2.00,5.00,10.0及20.0 μg∙mL-1的系列标准溶液,按“2.4”项处理后,进行HPLC分析,以浓度(
2.7.4 加样回收率 精密称取已测定含量的去水卫矛醇原料约10 mg,置100 mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取1 mL,置20 mL量瓶中,分别精密加入质量浓度为100 μg·mL-1的去水卫矛醇对照品溶液0.6,1.0,1.4 mL,用水稀释至刻度,摇匀,作为浓度水平80%,100%和120%的回收率溶液,每个浓度水平配制3份。按“2.4”项处理后,进行HPLC分析。结果见
2.7.5 精密度实验 供试品溶液经衍生化反应后,按上述色谱条件连续进样6次,峰面积的RSD为1.15%,表明进样精密度良好。
2.7.6 重复性实验 配制6份供试品溶液,按“2.4”项处理后,进行HPLC分析。结果表明,6份样品含量RSD为1.44%,重复性良好。
2.7.7 稳定性实验 将供试品溶液按“2.4”项处理后,分别于0,2,4,6,10 h进行HPLC分析,与0h比较,不同时间峰面积在0 h峰面积的99.5%~100.8%范围内,去水卫矛醇衍生物在10 h内稳定性良好。另将供试品溶液在室温下放置不同时间后,进行衍生化HPLC分析,不同时间测定的含量在98%~102%,表明去水卫矛醇水溶液在室温至少可放置4 h。
取对照品溶液及供试品溶液,按“2.4”项处理后,进行HPLC分析,典型色谱图见图4。按外标法计算,样品的平均含量为100.5%。
去水卫矛醇具有环氧环的特征结构,可与DDTC发生衍生化反应,生成具有紫外吸收的衍生物,用广泛使用的紫外检测器检测。笔者考察不同温度(25,40,60 ℃)、加热时间(5,15,30,45,60,90和120 min)、衍生化试剂浓度(1%,2%,3%,5%和10%)以及不同反应体系pH值(6.0,7.0和8.0),发现药物与5% DDTC在pH 值7.0条件下,于40 ℃水浴加热30 min可衍生化完全。为了除去过量的衍生化试剂,避免其干扰衍生物的测定,实验比较了乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷和乙醚等试剂的萃取效率,发现乙醚和乙酸乙酯的效果最好,考虑到操作的简便性和安全性,最终选择乙酸乙酯作为萃取剂。
笔者建立了衍生化HPLC法测定去水卫矛醇含量,该方法线性范围宽,重复性好,稳定性高,简单易行,易于在普通实验室操作,不仅可用于去水卫矛醇原料的质量控制,还可用于去水卫矛醇制剂和生物样品的分析,对去水卫矛醇的新药开发、生产和临床应用具有重要的参考价值。
The authors have declared that no competing interests exist.