消癌平注射液调节核受体增强紫杉醇抑制卵巢癌A2780细胞增殖的机制

张湘奇¹^,, 陈君君², 杨姣¹^,², 石美智², 祁美娟³, 肖霄², 王洪斌⁴, 韩永龙¹^,²^,

1.上海交通大学附属第六人民医院药剂科,上海 200233

2.上海健康医学院附属第六人民医院东院药剂科,上海 201306

3.上海海洋大学食品学院,上海 201306

4.北加州大学药学院,美国加利福尼亚 CA95757

ZHANG Xiangqi¹^,, CHEN Junjun², YANG Jiao¹^,², SHI Meizhi², QI Meijuan³, XIAO Xiao², WANG Hongbin⁴, HAN Yonglong¹^,²^,

1.Department of Pharmacy, Shanghai Jiaotong University Affiliated the Sixth People's Hospital, Shanghai 200233,China

2.Department of Pharmacy, Shanghai University of Medicine & Health Sciences Affiliated the Sixth People's Hospital East Campus, Shanghai 201306,China

3.College of Food Sciences & Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306,China

4.College of Pharmacy, California North State University, California CA95757, USA

通信作者韩永龙(1975-),博士,主任药师,博士生导师,研究方向:临床药理学,药物代谢与药物动力学。电话:021-38297199,E-mail:yonglongh@126.com。

作者简介张湘奇(1994-),女,湖南临湘人,硕士,研究方向:中药药理学。ORCID:0000-0003-1491-3436。电话:021-24058789,Email:abigialzhang@163.com。

基金资助: 国家自然科学基金资助项目(81773949)

中图分类号: R969.2;R737.31 文献标识码: A 文章编号: 1004-0781(2019)06-0693-08

摘要:

目的探讨消癌平注射液通过调节核受体PXR/CAR增强紫杉醇抑制卵巢癌A2780细胞增殖的作用机制。方法分别将20,40,80,160 mg·mL^-1消癌平注射液,10,40,80,160 nmol·L^-1紫杉醇单用,或两药联用于人卵巢癌细胞A2780细胞株,采用噻唑蓝(MTT)法检测药物对细胞的抑制率,倒置相差显微镜观察药物对细胞形态的影响,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测药物对PXR、CAR及下游药物代谢酶CYP2C8、CYP3A4、CYP3A5和转运体P-gp的mRNA表达的影响,Western blotting法检测药物对PXR、CYP2C8蛋白表达的影响。结果消癌平注射液处理卵巢癌A2780细胞后,细胞增殖受到抑制,且随药物浓度增加、作用时间延长,抑制率显著增加;与紫杉醇单用组比较,消癌平注射液联用紫杉醇后对细胞增殖的抑制作用更为显著;RT-PCR和Western blotting结果显示消癌平注射液可抑制紫杉醇激活的PXR及下游代谢酶CYP2C8的mRNA和蛋白的表达。结论消癌平注射液与紫杉醇联用能够增强紫杉醇对卵巢癌A2780细胞增殖的抑制作用,其机制可能与消癌平注射液抑制与药物代谢相关的核受体PXR和下游药物代谢酶CYP2C8表达有关。

关键词: 消癌平注射液 ; 紫杉醇 ; 孕烷X受体 ; 药物代谢 ; CYP2C8酶

Abstract:

Objective To explore the mechanism of Xiaoaiping injection enhancing the inhibitory effect of paclitaxel on the proliferation of ovarian cancer cell A2780. Methods Ovarian cancer cell line A2780 were treated by Xiaoaiping injection (20,40,80,160 mg·mL^-1) or paclitaxel(10,40,80,160 nmol·L^-1) or Xiaoaiping injection combined with paclitaxel, respectively. The inhibition ratios of different drugs on the proliferation of A2780 cells were measured by MTT method. The changes in cell morphology after drug treatment were monitored by microscope. The mRNA expression of PXR, CAR and CYP2C8, CYP3A4, CYP3A5, transporter P-gp were detected by RT-PCR. The protein expression of PXR, CYP2C8 were measured by Western blotting. Results Xiaoaiping injection inhibits the proliferation of A2780 cells in a time- and concentration-dependent manner. Compared with paclitaxel treatment alone, Xiaoaiping injection combined with paclitaxel exhibit more significant inhibitory effect on A2780 cell proliferation RT-PCR and Western blotting results revealed that Xiaoaiping injection can significantly inhibit paclitaxel-induced over expression of PXR and CYP2C8. Conclusion Xiaoaiping injection can significantly enhance the inhibitory effect of paclitaxel on the proliferation of ovarian cancer A2780 cells. The mechanism may be associated with the inhibitory effect of Xiaoaiping on paclitaxel-induced overexpression of nuclear receptor PXR and its downstream drug metabolic enzyme CYP2C8.

Key words: injection ; Paclitaxel ; PXR ; Drug metabolism ; Enzyme ; CYP2C8

消癌平注射液(xiaoaiping injection,XAP)是由通关藤药材精制提取而成的中药抗肿瘤单方制剂,在临床上常与紫杉醇^[1]、吉非替尼^[2]、多柔比星^[3]等化学治疗(化疗)药物联合应用治疗肺癌、肝癌、胃肠肿瘤等,对化疗药物具有增效减毒作用,可以提高化疗药物的疗效。紫杉醇(paclitaxel,PTX)是卵巢癌的一线化疗药物,但毒性大,易引起耐药^[4];它在人体内主要经药物代谢酶细胞色素P₄₅₀酶(CYP)的亚型CYP3A4/5、CYP2C8和转运体P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)进行代谢消除^[5,6,7]。本课题组前期研究和文献报道均发现XAP可抑制肝微粒体中CYP3A4、CYP2C8活性,从而可能影响PTX在体内的代谢过程。核受体孕烷X受体(PXR)和组成型雄甾烷受体(CAR)可以调控包括细胞色素P₄₅₀酶,如CYP3A4、CYP2B6、CYP2C8等及转运体如P-gp等众多靶基因的转录表达^[8,9];同时有研究表明抑制PXR和CAR的表达,可抑制卵巢癌细胞的增殖并增加其对PTX的敏感性^[10,11]。因此,本研究拟在前期工作基础上从细胞水平探究XAP联用PTX对卵巢癌A2780细胞的增殖抑制作用,通过分析mRNA、蛋白表达变化明确XAP是否调节核受体PXR和CAR及下游的药物代谢酶来增强PTX抑制A2780细胞增殖。

1 材料与方法

1.1 实验药品及试剂

消癌平注射液(XAP,南京圣和药业有限公司,批号:201709111,规格:每支20 mL,每毫升注射液含生药1 g),紫杉醇注射液(PTX,海口市制药厂有限公司,批号:12171006,规格为5 mL:30 mg),胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青霉素、链霉素溶液(GIBCO公司),高糖达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM,HYCLONE公司),噻唑蓝(MTT,索莱宝生物科技有限公司),UNIQ-10 柱式Trizol总RNA抽提试剂盒、M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒、2X SG Fast qPCR预混液(生工生物工程公司),Anti-PXR抗体、Anti-CYP2C8抗体(ABCAM公司),β-actin小鼠单克隆抗体、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、RIPA裂解液(碧云天生物技术公司),山羊抗小鼠IgG HRP、山羊抗兔IgG HRP(BIOSHARP公司)。

1.2 细胞

人卵巢癌细胞系A2780,购自北纳生物公司。

1.3 仪器

生物安全柜(ESCO Class II BSC)、二氧化碳(CO₂)培养箱(Panasonic MCO-18AIC)、ME203电子分析天平(梅特勒-托利多仪器公司,感量:1 mg)、台式低温离心机(Beckman Microfuge 20R)、多功能酶标仪(Spectra Max i3x)、定量PCR仪(ABI Pro Flex)、实时荧光定量PCR仪(Roche Light Cycler 480II)、蛋白垂直电泳系统(Bio-rad mini-protean Tetra)、倒置相差荧光显微镜(Leica DMi8)。

1.4 细胞的培养

卵巢癌细胞A2780培养于含10%胎牛血清,1%青霉素:链霉素溶液(使青霉素和链霉素终浓度分别为100 U·mL^-1和100 μg·mL^-1)的DMEM高糖完全培养基中,培养条件为37 ℃,5%CO₂饱和湿度。培养2或3代后,取对数生长期细胞进行实验。

1.5 MTT 法检测细胞活力

调整细胞悬液密度至5×10⁴·mL^-1,接种于96孔培养板中,每孔100 μL,空白组加入相应量的无细胞培养基。细胞贴壁后根据药物浓度梯度加入含药培养基,XAP浓度梯度为20,40,80,160 mg·mL^-1,PTX浓度梯度为10,40,80,160 nmol·L^-1,各浓度PTX分别单用或与XAP 40 mg·mL^-1联用,对照组和空白组加入无药培养基,37 ℃、5%CO₂培养24和48 h。用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT粉末,制成5 mg·mL^-1 MTT溶液,各孔加入MTT溶液10 μL继续孵育4 h。弃去上清液,加入DMSO150 μL振荡,溶解紫色晶体10 min。用酶标仪测定在490 nm 波长下各孔的吸光度(A)值。计算细胞活力(%)=(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%,细胞活力值越低说明药物抑制率越高。平行实验重复3次。

1.6 细胞形态观察

收集对数生长期A2780细胞,制成密度为1×10⁵·mL^-1的细胞悬液,接种于6孔培养板中,每孔1 mL。细胞贴壁过夜后,根据药物分组,分别加入含药培养基,使终浓度分别为XAP 40 mg·mL^-1、PTX 10 nmol·L^-1、XAP 40 mg·mL^-1+ PTX 10 nmol·L^-1,空白对照组只加入无药培养基。加药作用细胞24和48 h后,用PBS溶液轻柔清洗3次,置于倒置相差荧光显微镜下观察摄像。

1.7 RT-PCR检测mRNA的表达

A2780细胞接种于6孔板中,每孔5×10⁵个细胞,细胞贴壁后用无血清培养基处理12 h,加入含药培养基,使终浓度分别为XAP 40 mg·mL^-1、PTX 10 nmol·L^-1、XAP 40 mg·mL^-1+ PTX 10 nmol·L^-1,空白对照组只加入无药培养基。作用12和24 h后,利用Trizol法提取总RNA,用酶标仪测定所提RNA纯度及浓度。按上样1000 ng计算各样品上样量,依照逆转录试剂盒说明书配制20 μL上样体系加入PCR小管中,置于PCR扩增仪,按42 ℃、45 min 合成cDNA,70 ℃、10 min终止反应的条件进行逆转录反应。以逆转录得到的cDNA为模板,按PCR扩增说明书,加入相应量的扩增溶液及引物,20 μL上样体系中含25 ng模板DNA、10 μmol·L^-1引物、10 μLRT-PCR Master Mix,96孔检测板离心后,放入荧光定量PCR仪上,PCR反应条件:①酶激活 95 ℃ 3 min ②变性 95 ℃ 3 s,退火延伸 60 ℃ 30 s,进行40个循环后降温得融解曲线,验证引物特异性。引物序列见表1。

基因名称	引物序列(5'→3')
PXR	Forward :TGTGAGTGCGTGTGTGTGAT
	Reverse :TGATTGTCAGCGTAGCCTTG
CAR	Forward :GCTGCAAGAGGAGATGGCACTG
	Reverse :CAGCGGCATCATGGCAGACAG
CYP2C8	Forward :TCCTGTGTTCACCGTGTATT
	Reverse :TCAATCAGGGCTTCCTTCAC
CYP3A4	Forward :TCATTGCTGTCTCCAACCTTCACC
	Reverse :GGCTTGCCTGTCTCTGCTTCC
CYP3A5	Forward :CCGACGTGATCAGAACAGTGCTAG
	Reverse :TGGTGAAGGTTGGAGACAGCAATG
P-gp	Forward :GATTGCTCACCGCCTGTCCAC
	Reverse :CGTGCCATGCTCCTTGACTCTG

表1 RT-PCR扩增所用的基因引物序列

Tab.1 Primer sequences of target genes in RT-PCR amplification

1.8 Western blotting检测蛋白的表达

A2780细胞接种于6孔板中,每孔5×10⁵个细胞,贴壁后用无血清培养基处理12 h,加入含药培养基,使终浓度分别为XAP 40 mg·mL^-1、PTX 10 nmol·L^-1、XAP 40 mg·mL^-1+ PTX 10 nmol·L^-1,空白对照组只加入无药培养基。作用24和48 h后,用预冷PBS洗涤1次,每孔加入含1%PMSF的RIPA裂解液200 μL,冰上裂解30 min,12 000×g离心20 min,收集上清液即为细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度,加入5倍上样缓冲液,沸水浴5 min。取蛋白25 μg进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)电泳,恒压180 V电泳30 min,然后换80 V电泳40 min,将胶上分离的蛋白电转到NC膜上,电转条件为半干电转恒压25 V持续30 min,以5%脱脂牛奶室温摇动封闭2 h,加入一抗(1:1000比例稀释)室温孵育2 h,TBST洗膜3次,每次10 min,加入二抗室温孵育1 h,TBST洗膜5次后以电化学发光(electrochemiluinescence,ECL)试剂盒检测蛋白印迹。以内参β-actin(ACTB)进行上样量校正。

1.9 统计学方法

采用Graphpad prism 6.0版软件分析,实验数据用均数±标准差( $\bar{x}$ ±s)表示,采用t检验和单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对A2780细胞活力的抑制作用

实验结果显示,XAP对细胞增殖的抑制作用呈现显著的时间依赖(P<0.05或P<0.01),见图1。各浓度PTX对A2780细胞活力的抑制作用并不显著,当作用时间延长,抑制作用随药物浓度升高而增强,最大抑制率约为50%。各浓度PTX与XAP 40 mg·mL^-1联用,可显著抑制A2780细胞活力,且与PTX组比较,抑制率显著增加(P<0.05或P<0.01),两药具有协同作用(图2)。通过Graphpad 6.0版软件分析可得:两药联用24 h,PTX的半数抑制浓度(IC₅₀)由917.823 nmol·L^-1降至384.541 nmol·L^-1;两药联用48 h,PTX的IC₅₀由97.022 nmol·L^-1降至28.340 nmol·L^-1。结果表明,XAP可显著抑制A2780细胞的增殖,且随着药物浓度升高及作用时间延长,抑制率升高;与PTX联用后,与PTX组比较,抑制作用增强,IC₅₀明显降低。根据上述结果,选用XAP40 mg·mL^-1+PTX10 nmol·L^-1进行后续实验。

图1 XAP对A2780细胞增殖的抑制作用($\bar{x}±s$,n=3)
与24 h比较,^*1P<0.05,^*2P<0.01

Fig.1 Inhibitory effect of XAP on A2780 cell proliferation($\bar{x}±s$,n=3)
Compared with 24 h,^*1P<0.05,^*2P<0.01

图2 PTX及与XAP联用24和48 h对A2780细胞增殖的抑制作用($\bar{x}±s$,n=3)
与PTX组比较,^*1P<0.05,^*2P<0.01

Fig.2 Inhibitory effect of PTX alone or combined with XAP for 24 h and 48 h on A2780 cell proliferation($\bar{x}±s$,n=3)
Compared with PTX group,^*1P<0.05,^*2P<0.01

2.2 对A2780细胞形态的影响

药物作用24 h后,对照组细胞形态呈上皮型贴壁生长,大小均一,紧密排列,形状多为多角形或类圆形,生长旺盛;XAP组贴壁细胞数较对照组减少,细胞较完整;PTX组及XAP+PTX组贴壁细胞数明显减少,视野中可见皱缩飘浮的死细胞,贴壁细胞内颗粒增多;对比发现,XAP+PTX组细胞数明显少于PTX组,细胞排列稀疏,形状不规则,伴有较多飘浮的死细胞和细胞碎片。药物作用48 h后,各药物组细胞形态变化与24 h相似,细胞碎片和皱缩漂浮的死细胞数量更为增多,见图3。

图3 XAP和PTX作用于A2780细胞24和48 h后形态(×200)

Fig.3 Morphology of A2780 cells treated with XAP and PTX for 24 h and 48 h(×200)

2.3 对A2780细胞PXR和CAR的mRNA表达水平的影响

各组药物分别作用12和24 h后,提取细胞总RNA,经过反转录、两步法扩增cDNA,按2^-ΔΔCt相对定量法计算目标片段的mRNA相对表达水平。扩增结果显示,加药作用12和24 h后,与对照组比较,PTX10 nmol·L^-1组PXR mRNA表达显著增加(P<0.01),而PTX与XAP 40 mg·mL^-1联用后,PXR mRNA表达与PTX组相比均显著降低(P<0.01),表达水平接近对照组(图4)。药物作用12 h后,XAP+PTX组CAR mRNA表达低于PTX组,加药24 h后XAP+PTX组CAR mRNA表达水平也低于PTX组,但差异无统计学意义(图5)。结果提示,PTX可显著上调A2780中PXR mRNA表达,与XAP联用后,PXR mRNA的表达被抑制。

图4 XAP和PTX作用于A2780细胞后PXR的mRNA水平($\bar{x}±s$,n=3)
与对照组比较,^*1P<0.01;与PTX组比较,^*2P<0.01

Fig.4 The mRNA level of PXR in A2780 cells after XAP and PTX treatment($\bar{x}±s$,n=3)
Compared with control group,^*1P<0.01; Compared with PTX group,^*2P<0.01

图5 XAP和PTX作用于A2780细胞后CAR的mRNA水平($\bar{x}±s$,n=3)

Fig.5 The mRNA level of CAR in A2780 cells after XAP and PTX treatment($\bar{x}±s$,n=3)

2.4 对A2780细胞内CYP2C8、CYP3A4、CYP3A5和P-gp mRNA表达水平的影响

各药物作用12和24 h后,与对照组比较,PTX10 nmol·L^-1组CYP2C8 mRNA表达显著增加(P<0.01),而PTX+XAP组CYP2C8 mRNA表达与PTX组相比明显降低(P<0.01)(图6)。各药物作用12和24 h后,CYP3A4 mRNA的表达变化趋势与CYP2C8相似,但仅PTX作用12 h可导致CYP3A4 mRNA表达显著增加(P<0.05),其余各组均差异无统计学意义(图7)。各药物作用12和24 h后,CYP3A5和P-gp mRNA表达变化均差异无统计学意义,见图8,9。结果提示,PTX能够显著上调A2780细胞中CYP2C8和CYP3A4 mRNA的表达,与XAP联用后,CYP2C8的表达水平降低。

图6 XAP和PTX作用于A2780细胞后CYP2C8的mRNA水平($\bar{x}±s$,n=3)
与对照组比较,^*1P<0.01;与PTX组比较,^*2P<0.01

Fig.6 The mRNA level of CYP2C8 in A2780 cells after XAP and PTX treatment($\bar{x}±s$,n=3)
Compared with control group,^*1P<0.01; Compared with PTX group,^*2P<0.01

图7 XAP和PTX作用于A2780细胞后CYP3A4的mRNA水平($\bar{x}±s$,n=3)
与对照组比较,^*1P<0.05

Fig.7 The mRNA level of CYP3A4 in A2780 cells after XAP and PTX treatment($\bar{x}±s$,n=3)
Compared with control group,^*1P<0.05

图8 XAP和PTX作用于A2780细胞后CYP3A5 mRNA水平($\bar{x}±s$,n=3)

Fig.8 The mRNA level of CYP3A5 in A2780 cells after XAP and PTX treatment($\bar{x}±s$,n=3)

图9 XAP和PTX作用于A2780细胞后P-gp mRNA水平($\bar{x}±s$,n=3)

Fig.9 The mRNA level of P-gp in A2780 cells after XAP and PTX treatment($\bar{x}±s$,n=3)

2.5 对A2780细胞内PXR和下游药物代谢酶CYP2C8蛋白表达水平的影响

Western blotting结果显示,药物作用24 h,与对照组比较,PTX10 nmol·L^-1组PXR和CYP2C8蛋白表达升高;与XAP联用后,因PTX激活PXR、CYP2C8蛋白表达降低,但差异无统计学意义(图10)。药物作用48 h,PTX 10 nmol·L^-1组PXR、CYP2C8蛋白表达高于对照组,XAP和PTX合用可显著抑制PXR、CYP2C8蛋白的表达(P<0.05)(图11)。结果提示,XAP+PTX可抑制由PTX激活的PXR、CYP2C8的蛋白表达。

图10 XAP和PTX作用于A2780细胞24 h后PXR、CYP2C8蛋白表达水平($\bar{x}±s$,n=3)

Fig.10 The protein level of PXR andCYP2C8 in A2780 cells after XAP and PTX treatment for 24 h($\bar{x}±s$,n=3)

图11 XAP和PTX作用于A2780细胞48 h后PXR、CYP2C8蛋白表达水平($\bar{x}±s$,n=3)
与对照组比较,^*1P<0.05;与PTX组比较,^*2P<0.05

Fig.11 The protein level of PXR and CYP2C8 in A2780 cells after XAP and PTX treatment for 48 h($\bar{x}±s$,n=3)
Compared with control group,^*1P<0.05; Compared with PTX group,^*2P<0.05

3 讨论

卵巢癌是妇科肿瘤中发病率第二、病死率第一的恶性肿瘤,PTX作为卵巢癌的一线化疗药物,目前已在临床上广泛应用。但其严重的毒副反应^[12]和易引发耐药^[13]的特点,影响它的疗效,因此临床常将PTX与其他抗癌药物联用^[14],以期达到增加药效、逆转耐药的治疗效果。近年来,化疗药物与中药联用逐渐引起重视,PTX与人参皂苷^[15]、香菇多糖^[16]、白藜芦醇^[17]等中药单体或提取物联用均已证实对肿瘤治疗有一定增效作用。

XAP可单用治疗肺癌、肝癌、胃肠肿瘤,联合放化疗治疗非小细胞肺癌等恶性肿瘤^[18],具有增效减毒的作用,能明显提高放化疗的临床疗效。有研究表明,XAP可阻滞肿瘤细胞周期^[19];诱导肿瘤细胞凋亡;甚至可以逆转肿瘤耐药,提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。本研究首先探究XAP单用和与PTX联用对卵巢癌A2780细胞增殖的抑制作用,寻找适合进行后续实验的药物浓度。由于XAP是中药制剂,故药物浓度用每毫升含有生药量表示。通过预实验确定实验药物浓度为XAP 20,40,80,160 mg·mL^-1和PTX 10,40,80,160 nmol·L^-1,MTT实验结果证明,XAP对肿瘤细胞活力的抑制作用随浓度增加和作用时间延长而显著增强,此结果与已发表文献基本一致^[2]。在与PTX联用24和48 h后,PTX对细胞增殖的抑制作用明显增强,PTX的IC₅₀降低2~3倍。依据此实验结果,选用XAP40 mg·mL^-1单用时对A2780细胞抑制率约为25%,且联合用药时可显著降低细胞存活率至40%~60%的药物浓度进行后续实验。而较高浓度XAP(80 mg·mL^-1)与PTX联用后对细胞形态及密度影响太大,不适合采用此浓度进行联合作用机制的研究。

PTX在人体内主要是经由药物代谢酶CYP2C8、CYP3A4/5和转运体P-gp介导的代谢消除,其中2/3的代谢清除是经由CYP2C8代谢转化为6α-羟基紫杉醇,而核受体PXR、CAR被证实可以调控多种药物代谢酶的转录表达,其中就包括CYP2C8、CYP3A4等CYP酶及转运体P-gp,且PXR、CAR底物种类繁多,PTX就是其激活剂之一,对PXR和CAR激活或抑制都会引起下游代谢酶及转运体的表达变化。本课题组前期研究发现XAP可以抑制人肝微粒体CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19及CYP3A4/5的活性^[20],故需要在细胞分子水平上证明XAP与PTX联合增效作用及其对核受体PXR/CAR和下游药物代谢酶和转运体在mRNA和蛋白水平表达量的变化。本研究采用RT-PCR的方法检测消癌平注射液对PXR和CAR两种核受体mRNA及紫杉醇的主要代谢酶CYP2C8、CYP3A4/5和转运体P-gp mRNA的影响,结果显示,PTX作用12和24 h均可显著增强细胞中核受体PXR mRNA的表达,进而引起其下游药物代谢酶CYP2C8 mRNA的表达水平显著升高,而联用PTX后,PXR和CYP2C8的mRNA水平明显降低。为检测XAP对mRNA翻译后蛋白表达的影响,笔者采用Western blotting检测有显著改变的基因编码的蛋白的表达情况。结果显示,XAP作用48 h对PXR和CYP2C8蛋白的表达有显著抑制作用,证实在卵巢癌A2780细胞内核受体PXR与药物代谢酶CYP2C8表达呈正相关性,XAP可以抑制核受体PXR,影响XAP经CYP2C8的代谢消除,从而增加PTX在肿瘤细胞内的浓度,导致PTX药效增强。以往研究中药与PTX联用增效的角度大都局限在肿瘤凋亡、自噬等机制,本研究创新性地将核受体-药物代谢酶途径对PTX药效的影响作为立足点,探究中药制剂XAP通过影响PTX代谢效率而增强其药效的作用,为中药化疗药联用增效机制提供了新思路。

综上所述,XAP可增强PTX对卵巢癌A2780细胞生长的抑制作用,其机制可能与XAP抑制PTX对PXR的激活和下游药物代谢酶CYP2C8的表达,从而影响PTX代谢消除过程,增强肿瘤细胞对PTX敏感性有关。以上结果提示,XAP与PTX联用对卵巢癌的治疗有一定增效作用,为临床上XAP与PTX联用提供理论依据。但此实验仅为体外细胞实验,还需要进一步在体内实验及酶活性实验中对两药的联合作用效果和作用机制进行验证。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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[3]	HUANG T,GONG W H,ZOU C P,et al.Marsdenia tenaci-ssima extract sensitizes MG63 cells to doxorubicin-induced apoptosis[J].Genet Mol Res,2014,13(1):354-362. DOI:10.4238/2014.January.21.3 URL [本文引用:1]
[4]	GARCIA-MARTIN E,PIZARRO R M,MARTINEZ C,et al.Acquired resistance to the anticancer drug paclitaxel is associated with induction of cytochrome P₄₅₀ 2C8[J].Pharmacogenomics,2006,7(4):575-85. Introduction:We have previously shown that human colorectal cancer tissue is able to inactivate the anticancer drug paclitaxel through cytochrome P450 (CYP)2C8 and CYP3A4 metabolisms. The aim of this study was to evaluate whether changes in the expression levels of genes coding for such enzymes are related to anticancer drug resistance after long-term exposure to the drug.Methods:Human colorectal cancer cells (Caco-2) that are sensitive to paclitaxel were exposed to increasing concentrations of the drug from 0–25002nM during one year, in order to select paclitaxel-resistant cells. Subsequently, we compared the sensitivity to paclitaxel and the extent of expression of theCYP2C8,CYP3A4andCYP3A5genes in original and resistant cells.Results:Resistant cancer cells displayed a 246-fold increased lethal dose (LD)50to paclitaxel (p02<020.004) as compared with original cancer cells. A 4.4-fold (p02=020.005) enhancement ofCYP2C8expression and a 5.6-fold (p02=020.001) increase of multidrug resistance (MDR)1 expression was observed in resistant cells exposed to paclitaxel. When paclitaxel was removed from the culture medium,CYP2C8,but notMDR1expression, reverted to basal levels and the resistance to paclitaxel decreased 3.2-fold (p02=020.005). No major changes in the expression levels ofCYP3A4andCYP3A5were observed.Conclusions:Caco-2 cells are capable of increasing the expression levels ofCYP2C8as a response to long-term exposure to paclitaxel. This study provides evidence for a mechanism of acquired resistance to anticancer therapy based on the induction of anticancer-metabolizing enzymes. DOI:10.2217/14622416.7.4.575 PMID:3222216753005 URL [本文引用:1]
[5]	HARMSEN S,MEIJERMAN I,BEIJNEN J H,et al.Nuclear receptor mediated induction of cytochrome P₄₅₀ 3A4 by anticancer drugs:a key role for the pregnane X receptor[J].Cancer Chemother Pharmacol,2009,64(1):35-43. DOI:10.1007/s00280-008-0842-3 URL [本文引用:1]
[6]	KUDO T,OZAKI Y,KUSANO T,et al.Effect of buffer conditions on CYP2C8-mediated paclitaxel 6alpha-hydroxylation and CYP3A4-mediated triazolam alpha- and 4-hydroxylation by human liver microsomes[J].Xenobiotica,2016,46(3):241-246. DOI:10.3109/00498254.2015.1071502 URL [本文引用:1]
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[12]	吴畏. 1例卵巢癌化疗患者神经毒性治疗的药学监护[J].医药导报,2014,33(12):1650-1652. 目的探讨临床药师参与药物治疗方案的制订以及提供药学服务的方法。方法临床药师参与1例卵巢癌患者神经毒性的治疗过程,从化学治疗方案的制订、给药剂量的计算、辅助用药的选择、药物不良反应监测等环节,为患者提供全面的药学服务。结果临床药师的建议被采纳,提高了临床治疗效果,减少了药品不良反应发生。结论临床药师参与医师查房,可以协助医师制订安全、有效的治疗方案,在临床药物合理使用中发挥重要作用。 DOI:10.3870/yydb.2014.12.031 [本文引用:1]
[13]	邓艾平,王奕,刘珏,等.叶酸壳寡糖修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒对耐紫杉醇人卵巢癌细胞增殖的影响[J].医药导报,2018,37(6):662-666. [本文引用:1]
[14]	ELSERAFI M M,ZEENELDIN A A,ABDELSALAM I M,et al.First-line paclitaxel and cisplatin used sequentially or in combination in metastatic breast cancer:a phase II randomized study[J].J Egypt Natl Cancer Inst,2018,30(1):11-20. [本文引用:1]
[15]	杨蕾,张振海,贾晓斌.人参稀有皂苷组分联合紫杉醇治疗A549肺癌的实验研究[J].中国中药杂志,2018,43(7):1446-1452. 中药组分联合化疗药物抗肿瘤是近年来临床肿瘤治疗的新方向.该研究通过MTT法优选人参稀有皂苷组分与紫杉醇的最优配比,并探讨其对肺癌A549细胞增殖、凋亡能力及体内抗肿瘤药效的影响.研究发现,优选出人参稀有皂苷组分与紫杉醇的配比为4∶6时,对肺癌A549细胞增殖的抑制作用与等剂量的紫杉醇相当.进一步研究发现,联合使用对A549细胞凋亡的诱导作用显著增加,同时上调caspase-3蛋白表达,下调Bcl-2/Bax比率.荷瘤鼠模型显示两者联用可以显著抑制肿瘤生长,并减轻紫杉醇抗肿瘤时的肝毒副作用.该文建立的人参稀有皂苷组分-紫杉醇多组分体系,通过促进紫杉醇诱导细胞凋亡抑制肺癌A549细胞的增殖和生长,减少了紫杉醇的用量,达到降低紫杉醇的毒性,增强抗肺癌的效果,为后期研究及临床应用提供了理论依据. URL [本文引用:1]
[16]	霍小蕾,韩玲娜,裴振,等.香菇多糖联合紫杉醇对食管癌细胞生物学行为的影响[J].东南大学学报(医学版),2017,36(6):897-900. [本文引用:1]
[17]	卢晨欣,孙警辉,伍春莲.白藜芦醇与紫杉醇联合用药对人喉癌Hep-2细胞凋亡机制的研究[J].中国中药杂志,2016,41(3):476-83. [本文引用:1]
[18]	胡赤丁. 消癌平治疗晚期恶性肿瘤33例[J].医药导报,2001,20(10):623. [本文引用:1]
[19]	FAN W,SUN L,ZHOU J Q,et al.Marsdenia tenacissima extract induces G₀/G₁ cell cycle arrest in human esophageal carcinoma cells by inhibiting mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway[J].Chin J Nat Med,2015,13(6):428-437. [本文引用:1]
[20]	刘丽雅,韩永龙,余奇,等.消癌平注射液等4种抗肿瘤中药注射剂对人肝微粒体中CYP450酶7种亚型的体外抑制作用研究[J].中国临床药理学与治疗学,2014,19(5):522-527. 目的：考察消癌平注射液等4种抗肿瘤中药注射剂对人肝微粒体CYP450酶7种亚型 CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 和CYP3A4/5 的体外抑制作用。方法：消癌平注射液等4种抗肿瘤中药注射剂分别与7种CYP450酶亚型对应的混合探针药物在人肝微粒体中共同孵育，采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法同时测定这7种探针药物的代谢产物：对乙酰氨基酚、羟基安非他酮、去甲阿莫地喹、4-羟基双氯芬酸、4-羟基美芬妥英、右啡烷和1-羟基咪达唑仑的浓度，分别代表CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 和CYP3A4/5 的活性，其对CYP450酶亚型的抑制程度以IC50值表示。结果：在体外人肝微粒体孵育体系中，消癌平注射液对CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4/5的IC50值分别为0.51%、1.34%、1.42%、0.93%、1.09%和0.75%，艾迪注射液对CYP2C8的IC50值为0.21%；消癌平注射液对CYP2D6的IC50值为2.58%，艾迪注射液对CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4/5的IC50值分别为13.24%、16.31%、4.27%和3.73%，华蟾素注射液对CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8和CYP2D6的IC50值分别为3.50%、28.01%、20.32%和32.59%，康艾注射液对CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2D6和CYP3A4/5的IC50值分别为2.55%、15.32%、1.44%、1.72%和3.99%，均高于各自的日用药量浓度；在测定浓度范围内，艾迪注射液对CYP1A2和CYP2D6，华蟾素注射液对CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4/5，康艾注射液对CYP2C9和CYP2C19的活性抑制率均小于50%。结论：在体外，正常剂量下，消癌平注射液对人CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4/5，艾迪注射液体对人CYP2C8均有明显抑制作用；消癌平注射液对CYP2D6，艾迪注射液对CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4/5，华蟾素注射液对CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8和CYP2D6，康艾注射液对CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2D6和CYP3A4/5，均无明显抑制作用；艾迪注射液对CYP1A2和CYP2D6，华蟾素注射液对CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4/5，康艾注射液对CYP2C9和CYP2C19，均无抑制作用。 Magsci [本文引用:1]

Total aglycones from Marsdenia tenacissima increases antitumor efficacy of paclitaxel in nude mice

2014

... 消癌平注射液(xiaoaiping injection,XAP)是由通关藤药材精制提取而成的中药抗肿瘤单方制剂,在临床上常与紫杉醇^[1]、吉非替尼^[2]、多柔比星^[3]等化学治疗(化疗)药物联合应用治疗肺癌、肝癌、胃肠肿瘤等,对化疗药物具有增效减毒作用,可以提高化疗药物的疗效.紫杉醇(paclitaxel,PTX)是卵巢癌的一线化疗药物,但毒性大,易引起耐药^[4];它在人体内主要经药物代谢酶细胞色素P₄₅₀酶(CYP)的亚型CYP3A4/5、CYP2C8和转运体P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)进行代谢消除^[5,6,7].本课题组前期研究和文献报道均发现XAP可抑制肝微粒体中CYP3A4、CYP2C8活性,从而可能影响PTX在体内的代谢过程.核受体孕烷X受体(PXR)和组成型雄甾烷受体(CAR)可以调控包括细胞色素P₄₅₀酶,如CYP3A4、CYP2B6、CYP2C8等及转运体如P-gp等众多靶基因的转录表达^[8,9];同时有研究表明抑制PXR和CAR的表达,可抑制卵巢癌细胞的增殖并增加其对PTX的敏感性^[10,11].因此,本研究拟在前期工作基础上从细胞水平探究XAP联用PTX对卵巢癌A2780细胞的增殖抑制作用,通过分析mRNA、蛋白表达变化明确XAP是否调节核受体PXR和CAR及下游的药物代谢酶来增强PTX抑制A2780细胞增殖. ...

Enhancement of gefitinib-induced growth inhibition by Marsdenia tenacissima extract in non-small cell lung cancer cells expressing wild or mutant EGFR

2014

... XAP可单用治疗肺癌、肝癌、胃肠肿瘤,联合放化疗治疗非小细胞肺癌等恶性肿瘤^[18],具有增效减毒的作用,能明显提高放化疗的临床疗效.有研究表明,XAP可阻滞肿瘤细胞周期^[19];诱导肿瘤细胞凋亡;甚至可以逆转肿瘤耐药,提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性.本研究首先探究XAP单用和与PTX联用对卵巢癌A2780细胞增殖的抑制作用,寻找适合进行后续实验的药物浓度.由于XAP是中药制剂,故药物浓度用每毫升含有生药量表示.通过预实验确定实验药物浓度为XAP 20,40,80,160 mg·mL^-1和PTX 10,40,80,160 nmol·L^-1,MTT实验结果证明,XAP对肿瘤细胞活力的抑制作用随浓度增加和作用时间延长而显著增强,此结果与已发表文献基本一致^[2].在与PTX联用24和48 h后,PTX对细胞增殖的抑制作用明显增强,PTX的IC₅₀降低2~3倍.依据此实验结果,选用XAP40 mg·mL^-1单用时对A2780细胞抑制率约为25%,且联合用药时可显著降低细胞存活率至40%~60%的药物浓度进行后续实验.而较高浓度XAP(80 mg·mL^-1)与PTX联用后对细胞形态及密度影响太大,不适合采用此浓度进行联合作用机制的研究. ...

Marsdenia tenaci-ssima extract sensitizes MG63 cells to doxorubicin-induced apoptosis

2014

Acquired resistance to the anticancer drug paclitaxel is associated with induction of cytochrome P 2C8

2006

Nuclear receptor mediated induction of cytochrome P 3A4 by anticancer drugs:a key role for the pregnane X receptor

2009

Effect of buffer conditions on CYP2C8-mediated paclitaxel 6alpha-hydroxylation and CYP3A4-mediated triazolam alpha- and 4-hydroxylation by human liver microsomes

2016

Role of cytochrome P activity in the fate of anticancer agents and in drug resistance:focus on tamoxifen,paclitaxel and imatinib metabolism

2005

Nuclear receptors PXR and CAR:implications for drug metabolism regulation,pharmacogenomics and beyond

2013

Nuclear receptors in the multidrug resistance through the regulation of drug-metabolizing enzymes and drug transporters

2012

Pre-gnane X receptor and human malignancy

2013

Inhibition of pregnane X receptor pathway contributes to the cell growth inhibition and apoptosis of anticancer agents in ovarian cancer cells

2016

1例卵巢癌化疗患者神经毒性治疗的药学监护

2014

... 卵巢癌是妇科肿瘤中发病率第二、病死率第一的恶性肿瘤,PTX作为卵巢癌的一线化疗药物,目前已在临床上广泛应用.但其严重的毒副反应^[12]和易引发耐药^[13]的特点,影响它的疗效,因此临床常将PTX与其他抗癌药物联用^[14],以期达到增加药效、逆转耐药的治疗效果.近年来,化疗药物与中药联用逐渐引起重视,PTX与人参皂苷^[15]、香菇多糖^[16]、白藜芦醇^[17]等中药单体或提取物联用均已证实对肿瘤治疗有一定增效作用. ...

叶酸壳寡糖修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒对耐紫杉醇人卵巢癌细胞增殖的影响

2018

First-line paclitaxel and cisplatin used sequentially or in combination in metastatic breast cancer:a phase II randomized study

2018

人参稀有皂苷组分联合紫杉醇治疗A549肺癌的实验研究

2018

香菇多糖联合紫杉醇对食管癌细胞生物学行为的影响

2017

白藜芦醇与紫杉醇联合用药对人喉癌Hep-2细胞凋亡机制的研究

2016

消癌平治疗晚期恶性肿瘤33例

2001

Marsdenia tenacissima extract induces G/G cell cycle arrest in human esophageal carcinoma cells by inhibiting mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway

2015

消癌平注射液等4种抗肿瘤中药注射剂对人肝微粒体中CYP450酶7种亚型的体外抑制作用研究

2014

... PTX在人体内主要是经由药物代谢酶CYP2C8、CYP3A4/5和转运体P-gp介导的代谢消除,其中2/3的代谢清除是经由CYP2C8代谢转化为6α-羟基紫杉醇,而核受体PXR、CAR被证实可以调控多种药物代谢酶的转录表达,其中就包括CYP2C8、CYP3A4等CYP酶及转运体P-gp,且PXR、CAR底物种类繁多,PTX就是其激活剂之一,对PXR和CAR激活或抑制都会引起下游代谢酶及转运体的表达变化.本课题组前期研究发现XAP可以抑制人肝微粒体CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19及CYP3A4/5的活性^[20],故需要在细胞分子水平上证明XAP与PTX联合增效作用及其对核受体PXR/CAR和下游药物代谢酶和转运体在mRNA和蛋白水平表达量的变化.本研究采用RT-PCR的方法检测消癌平注射液对PXR和CAR两种核受体mRNA及紫杉醇的主要代谢酶CYP2C8、CYP3A4/5和转运体P-gp mRNA的影响,结果显示,PTX作用12和24 h均可显著增强细胞中核受体PXR mRNA的表达,进而引起其下游药物代谢酶CYP2C8 mRNA的表达水平显著升高,而联用PTX后,PXR和CYP2C8的mRNA水平明显降低.为检测XAP对mRNA翻译后蛋白表达的影响,笔者采用Western blotting检测有显著改变的基因编码的蛋白的表达情况.结果显示,XAP作用48 h对PXR和CYP2C8蛋白的表达有显著抑制作用,证实在卵巢癌A2780细胞内核受体PXR与药物代谢酶CYP2C8表达呈正相关性,XAP可以抑制核受体PXR,影响XAP经CYP2C8的代谢消除,从而增加PTX在肿瘤细胞内的浓度,导致PTX药效增强.以往研究中药与PTX联用增效的角度大都局限在肿瘤凋亡、自噬等机制,本研究创新性地将核受体-药物代谢酶途径对PTX药效的影响作为立足点,探究中药制剂XAP通过影响PTX代谢效率而增强其药效的作用,为中药化疗药联用增效机制提供了新思路. ...