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医药导报
医药导报, 2019, 38(6): 726-730
doi: 10.3870/j.issn.1004-0781.2019.06.008
意大利牛舌草提取物抗炎镇咳与体外抑菌作用*
Effects of Extracts of Anchusa italica Retz. on Anti-inflammatory,Cough-relieving and Bacteriostasis in Vitro
徐晓琴1,, 陈良2, 张娟1, 孙宇1, 卿德刚1, 倪慧1,
1.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所,乌鲁木齐 830002
2.新疆医科大学附属中医医院,乌鲁木齐 830000
XU Xiaoqin1,, CHEN Liang2, ZHANG Juan1, SUN Yu1, QING Degang1, NI Hui1,
1.Xinjiang Institute of Chinese Traditional Medical and Ethical Materia Medical, Urumqi 830002,China
2.Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830000, China
通信作者 倪慧(1964-),女,新疆乌鲁木齐人,研究员,硕士,从事中药民族药研究与开发工作。电话:0991-8855334,E-mail:xjnihui@163.net。

作者简介 徐晓琴(1984-),女,新疆乌鲁木齐人,副研究员,硕士,从事中药质量控制与新制剂开发与研究工作。ORCID:0000-0002-0668-6627。电话:0991-8855334,E-mail:xjxuxq@163.com。
基金资助: 新疆维吾尔自治区公益性科研项目(KYGY2016173)
中图分类号: R965     文献标识码: A     文章编号: 1004-0781(2019)06-0726-05
摘要:

目的 研究意大利牛舌草提取物抗炎镇咳及体外抑菌作用,为临床应用提供科学依据。方法 采用角叉菜胶致大鼠足趾肿胀实验,观察意大利牛舌草不同提取物的抗炎作用;采用浓氨水诱导小鼠止咳实验,观察不同提取物的镇咳作用;采用试管稀释法,评价不同提取物对5种菌株(金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌)的体外抑菌作用。结果 意大利牛舌草0.63 g·kg-1、2.52 g·kg-1乙醇提取部位、2.52 g·kg-1乙酸乙酯与正丁醇部位在致炎后的不同时间段内抑制大鼠足趾肿胀程度显著(P<0.01),2.52 g·kg-1乙醇提取部位抑制炎症效果与地塞米松组作用相当,正丁醇部位与乙醇部位的抑制炎症效果差异无统计学意义;小鼠镇咳实验中,0.90 g·kg-1、3.04 g·kg-1乙醇提取部位与3.04 g·kg-1正丁醇部位的延长小鼠咳嗽潜伏期作用与急支糖浆差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),且上述部位的3.04 g·kg-1剂量组小鼠咳嗽次数明显减少(P<0.05);4种意大利牛舌草提取物分别对枯草芽孢杆菌具有抑菌活性,其中乙酸乙酯部位与水溶部位的抑制作用较强。结论 意大利牛舌草乙醇提取部位及正丁醇部位具有抗炎,镇咳的药理活性,而乙酸乙酯部位对枯草芽孢杆菌具有体外抑制活性。
关键词: 意大利牛舌草 ; 抗炎作用 ; 镇咳作用 ; 抑菌作用

Abstract:

Objective To investigate the anti-inflammatory,antitussive and in vitro bacteriostatic effects of the extract of Anchusa italica Retz. ,so as to scientific basis for clinical application. Methods The anti-inflammatory effect of different extracts was observed by inflammation model induced by carrageen glue toes swelling of rats; Antitussive effect was observed by ammonia-induced cough model; The in vitro bacteriostasis effects of different extracts on 5 strains (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Candida albicans) was evaluate by the tube dilution method . Results The swelling of rat toes was significantly inhibited at different time after inflammation by 0.63 g·kg-1, 2.52 g·kg-1 of ethanol extracts from Anchusa italica Retz., 2.52 g·kg-1 of ethyl acetate and n-butanol parts (P<0.01), and The inhibitory effect of 2.52 g·kg-1 ethanol extracts on inflammation was similar to that of dexamethasone group, but there was no statistically significant difference between n-butanol parts and ethanol parts; In the antitussive experiment in mice, 0.90 g·kg-1, 3.04 g·kg-1 ethanol extracts, and 3.04 g·kg-1 of the n-butanol extracts had better effect than the jizhi syrup in prolonging the incubation period of cough in mice (P<0.05 or P<0.01), and the parts of the 3.04 g·kg-1dose group could significantly reduced the frequency of cough (P<0.05); All extracts had antibacterial activity against Bacillus subtilis, and the inhibition levels of ethyl acetate and water soluble parts were stronger. Conclusion The ethanol extracts and n-butyl alcohol parts has anti-inflammatory and antitussive pharmacological activities, and ethyl acetate parts has inhibitory activity against bacillus subtilis in vitro.
Key words: Retz. ; Anti-inflammatory activity ; Antitussive effects ; Bacteriostatic action

意大利牛舌草(Anchusa italica Retz.)又名牛舌草[1]“高孜万”[2],源于紫草科牛舌草属植物,主要分布于地中海和热带地区[3],为维吾尔医临床常用药,收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》维药分册中,全草入药,具有生湿生热、润燥消炎、止咳平喘等功效,广泛用于心血管疾病与呼吸系统疾病的治疗,如肺炎、高血压、结核病、寒性咳嗽、感冒等[4],是维吾尔医经典复方不可缺少的主药之一[5]。意大利牛舌草含有挥发油、黄酮类、三萜类、酚类和生物碱类等多种成分[6],现代药理学研究证实其具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、中枢神经系统作用、内分泌作用以及保护心血管等药理活性[5],但是,在抗炎、镇咳、体外抑菌等方面的研究较少,本课题组基于意大利牛舌草的临床应用,对不同提取物展开活性评价,筛选其有效部位,为阐明意大利牛舌草抗炎、镇咳的药理作用及发挥药效的物质基础提供科学参考。

1 材料与方法
1.1 实验动物

SD大鼠,无特定病原体(SPF)级,体质量150~180 g,110只,雄性;昆明种小鼠,SPF级,18~22 g,100只,雌雄各半,购自新疆实验动物研究中心。实验动物生产许可证号:SYXK(新)2016-0007。在温度为20~24 ℃、相对湿度为40%~60%、12 h光照交替的环境中饲养,自由摄食饮水。

1.2 仪器

Mettler Toledo AB265-S电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司,感量:0.1 mg);UPT-I-5T优普超纯水仪(成都纯化科技有限公司);YLS-8A多功能诱咳引喘仪(济南益延科技有限公司);BSC-1300II A/ B3生物安全柜(上海博讯实业有限公司);SPX-250B-Z生化培养箱(上海博讯实业有限公司);KXQ.SG46.280高压灭菌锅(上海佳腾实验设备有限公司);JM300/0.1电子天平(余姚纪铭称重校验设备有限公司,感量:0.1 mg)。

1.3 材料

意大利牛舌草(批号:15120405,新疆奇康哈博中维药饮片有限公司,经新疆医科大学李永和教授鉴定,符合维吾尔药地方标准要求);意大利牛舌草提取物(实验室自制,含芦丁0.52%);角叉菜胶(Sigma公司,25 g,批号:SLBR0530V);醋酸地塞米松片(天津药业集团新郑股份有限公司,批号:141014,规格:每片0.75 mg);急支糖浆(太极集团重庆涪陵制药厂有限公司,规格:200 mL);左氧氟沙星(武汉精细化工,批号:1502102);营养肉汤培养基(青岛日水生物有限责任公司,批号:20150204);营养琼脂培养基(青岛日水生物有限责任公司,批号:20160601);二甲亚砜(SIGMA-VETEC公司,批号:WXDB2507V)。

菌株:大肠埃希菌(ATCC25922);铜绿假单胞菌(ATCC27853);金黄色葡萄球菌(ATCC25923);白念珠菌[CMCC(F)98001];枯草芽孢杆菌(CMCC63501),以上菌株购自新疆维吾尔自治区药品检验所。

1.4 意大利牛舌草提取物的制备

取干燥的意大利牛舌草8.0 kg,粉碎成粗粉,以25倍量体积分数为70%乙醇溶液加热回流提取1.5 h,提取2次,滤过,收集合并提取液,低温浓缩至完全无醇味,取适量浓缩干燥得到乙醇粗提物(提取率17.37%);剩余药液分批取适量,依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇溶剂萃取(其提取率分别为0.50%,0.48%,0.74%,3.88%),收集各部位萃取液及水溶液减压回收溶剂,干燥得到不同萃取部位浸膏,其中乙酸乙酯、正丁醇、水溶物中芦丁含量分别为0.32%,1.57%,0.17%。

1.5 不同提取物抗炎实验

采用大鼠足趾肿胀急性炎症模型[7,8],将SD大鼠按照随机数字表分为11组,每组10只,分别为空白对照组、模型对照组、地塞米松组(醋酸地塞米松5 mg·kg-1),以及乙醇粗提物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水溶物的大、小剂量组(按生药量计为2.52,0.63 g·kg-1),按10 mL·kg-1容积每日灌胃1次,空白对照组给予等量0.9%氯化钠溶液,连续给药7 d,末次给药1 h后用千分尺测定每只大鼠右后足趾厚度,然后在右后脚跖皮下注射1%角叉菜胶溶液0.1 mL,空白对照组注射等容积0.9%氯化钠溶液,分别于注射后0.5,1,2,4,6 h测量大鼠右后足趾厚度,按下式计算足趾肿胀度(mm)。

肿胀度(mm)=致炎后足趾厚度-致炎前足趾厚度。

1.6 不同提取物镇咳实验

取咳嗽敏感小鼠按照随机数字表分成10组[9,10],每组10只,分别为空白对照组(0.9%氯化钠溶液,30 mL·kg-1),急支糖浆组(急支糖浆,13 g·kg-1),以及乙醇粗提物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水溶物大、小剂量组(按生药量计为3.04,0.90 g·kg-1),每天灌胃给药1次,连续5 d,灌胃体积均为0.2 mL·(10 g)-1,第5天给药1 h后,将小鼠逐一放入诱咳引喘仪的密闭干燥笼具内,恒压喷入体积分数为25%浓氨水气雾,喷雾4 s引咳,观察记录咳嗽潜伏期及2 min内咳嗽次数,比较不同提取物的镇咳作用。咳嗽标准:腹肌收缩,同时张大嘴,有时有咳声,若潜伏期<1 min,且在1 min内出现3次以上典型咳嗽者为敏感动物,否则淘汰。

1.7 不同提取物体外抑菌实验

1.7.1 菌悬液的配置 取检测菌冻存液,37 ℃复苏,取冻存液10 μL加入营养肉汤培养基5 mL中,37 ℃摇床扩大培养12 h,经平板分离后用无菌接种环挑选单菌落,加入营养肉汤培养基50 mL,培养16 h,麦氏比浊法确定菌液浓度至0.5麦氏标准液。

1.7.2 药物配置 称取4种提取物干粉各2.56 g,分别溶于营养肉汤10 mL中,乙酸乙酯提取物溶于含4%二甲亚砜的营养肉汤培养基10 mL中,搅拌混匀,115 ℃,30 min灭菌。按两倍梯度稀释后并按1:1与含菌液培养基混合,配置左氧氟沙星浓度为128,64,32,16,8,4,2,1和0.5 mg·mL-1的溶液。

1.7.3 左氧氟沙星(阳性药)配置 按两倍梯度稀释法,配置左氧氟沙星浓度为128,64,32,16,8,4,2,1和0.5 μg·mL-1的溶液。

1.7.4 体外抑菌实验 采用试管稀释法,取配制好的浓度药液加入试管每管3 mL,每管加待测菌液3 mL,37 ℃培养箱培养24 h。结果判定以肉眼观察,以试管中无细菌生长者药物最低浓度为该实验菌最小抑菌浓度(MIC),如药物高浓度组颜色较深无法观测时,取药物前3个稀释度做涂布观测;吸取未长菌试管培养液,每皿100 μL涂布于营养琼脂平板,续培养48 h后观察菌的生长情况,无菌生长平板所含的最低药物浓度即为最低杀菌浓度值(MBC)。

1.8 统计学方法

采用SPSS17.0版软件统计,计量资料以均数±标准差( x ¯ ±s)表示,采用单因素方差分析,多组间均数比较采用One-way ANOVA处理,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 抗炎实验结果

与空白对照组比较,模型对照组大鼠足趾肿胀度显著增加(P<0.01);与模型对照组比较,0.63,2.52 g·kg-1意大利牛舌草乙醇提取物组在致炎后2 h内各时间段抑制大鼠足趾肿胀程度显著(P<0.01);2.52 g·kg-1乙酸乙酯与正丁醇组在致炎后的4 h各时间段内抑制大鼠足趾肿胀程度显著(P<0.01),见表1。

表1 不同极性提取物对大鼠足趾肿胀度的影响
Tab.1 Effect of extracts with different polar on toe swelling of rats mm,$\bar{x}±s$,n=10
组别 剂量/
(g·kg-1)		 足趾肿胀度
0.5 h 1 h 2 h 4 h 6 h
空白对照组 — 1.68±0.38*1 1.26±0.6*1 1.01±0.30*1*2 0.32±0.32*1 0.09±0.17*1
模型对照组 — 2.55±0.25*3 2.40±0.34*3 2.37±0.31*3 1.35±0.27*3 0.47±0.29*2
地塞米松组 5 1.27±0.41*1 1.52±0.41*1 1.30±0.12*1 0.46±0.20*1 0.12±0.22*4
乙醇
小剂量组 0.63 1.57±0.59*1 1.89±0.71*4 1.91±0.42*4*3 1.05±0.64*3 0.46±0.59*2
大剂量组 2.52 1.36±0.32*1 1.76±0.40*1 1.68±0.56*1 0.86±0.53*4*2 0.32±0.34
乙酸乙酯
小剂量组 0.63 2.14±0.40*3 1.95±0.61*4*2 1.91±0.64*4*3 1.22±0.55*3 0.31±0.28
大剂量组 2.52 1.80±0.79*1*2 1.53±0.13*1 1.68±0.42*1 0.94±0.60*1*2 0.18±0.20*4
正丁醇
小剂量组 0.63 1.96±0.64*1*3 2.15±0.57*3 2.03±0.71*3 1.14±0.46*3 0.18±0.24*4
大剂量组 2.52 1.68±0.43*1 1.74±0.27*1 1.68±0.25*1*2 0.95±0.31*1*2 0.14±0.19*4
水溶物
小剂量组 0.63 1.70±0.33*1 2.10±0.44*3 2.13±0.27*3 1.50±0.51*3 0.52±0.34*3
大剂量组 2.52 1.85±0.54*1*3 2.07±0.35*2 1.98±0.41*4*3 1.24±0.43*1*2 0.24±0.21

与模型对照组同一时间点比较,*1P<0.01,*4P<0.05;与地塞米松组同一时间点比较,*2P<0.05,*3P<0.01

Compared with model control group at the same time point,*1P<0.01,*4P<0.05; Compared with dexamethasone group at the same time point,*2P<0.05, *3P<0.01

表1 不同极性提取物对大鼠足趾肿胀度的影响

Tab.1 Effect of extracts with different polar on toe swelling of rats mm,$\bar{x}±s$,n=10

2.2 镇咳实验结果

在延长咳嗽潜伏期方面,与模型对照组比较,急支糖浆组、乙酸乙酯大剂量组,正丁醇大、小剂量组实验小鼠的咳嗽潜伏期均延长(P<0.05);乙醇提取物大、小剂量组及正丁醇大剂量组的延长潜伏期作用与急支糖浆组差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);在减少咳嗽次数方面,急支糖浆组,乙醇提取物大剂量组,乙酸乙酯及正丁醇大、小剂量组,水溶物大剂量组实验小鼠的咳嗽次数均减少,其中乙酸乙酯大剂量组与正丁醇大剂量组咳嗽次数较急支糖浆组明显减少(P<0.01),见表2。

表2 各组小鼠对浓氨水致咳嗽反应
Tab.2 Ammonia-induced cough in different groups of mice $\bar{x}±s$,n=10
组别 剂量/
(g·kg-1)		 咳嗽潜伏期/
s		 2 min咳嗽
次数
模型对照组 - 30.87±6.44*1 45.35±10.04*1
急支糖浆组 13 40.47±2.29*2 36.77±9.60*2
乙醇
小剂量组 0.90 27.33±7.49*3 37.15±8.92
大剂量组 3.04 29.83±3.61*1 37.03±9.35*2
乙酸乙酯
小剂量组 0.90 32.97±12.94 30.87±6.67*4
大剂量组 3.04 41.74±9.15*2 21.93±5.46*3*4
正丁醇
小剂量组 0.90 41.42±14.23*2 32.37±10.15*4
大剂量组 3.04 51.95±12.62*1*4 24.22±7.02*3*4
水溶物
小剂量组 0.90 32.90±11.48 39.00±10.43
大剂量组 3.04 39.47±10.53 36.4±6.69*2

与急支糖浆组比较,*1P<0.05,*3P<0.01;与模型对照组比较,*2P<0.05,*4P<0.01

Compared with jizhi syrup group,*1P<0.05,*3P<0.01; Compared with model control group,*2P<0.05,*4P<0.01

表2 各组小鼠对浓氨水致咳嗽反应

Tab.2 Ammonia-induced cough in different groups of mice $\bar{x}±s$,n=10

2.3 体外抑菌实验结果

由平板计数验证的菌落数均在范围内,则工作液浓度约为106 cfu·mL-1,符合营养肉汤稀释法前提条件,见表3。意大利牛舌草4种不同提取物对5种菌株的抑制能力不同。见表4。

表3 菌液稀释液浓度验证结果
Tab.3 Verification results of diluent concentration of bacteria liquid
菌株 菌落数
1×101 cfu·mL-1 1×102 cfu·mL-1
皿1 皿2 皿3 均值 皿1 皿2 皿3 均值
大肠埃希菌 27 32 29 29.33 127 188 92 135.67
金黄色葡萄球菌 6 2 1 3.00 103 96 80 93.00
枯草芽孢杆菌 1 19 17 12.33 129 207 211 182.33
铜绿假单胞菌 8 10 13 10.33 130 133 143 135.33
白念珠菌 31 21 22 24.67 191 182 228 200.33

表3 菌液稀释液浓度验证结果

Tab.3 Verification results of diluent concentration of bacteria liquid

表4 牛舌草提取物对5种菌株MIC和MBC结果
Tab.4 MIC and MBC of extracts of Anchusa italica Retz. on five strains mg·mL-1
组别 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 铜绿假单胞菌 白念珠菌
MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC
左氧氟沙星组 0.5×10-3 0.5×10-3 0.5×10-3 0.5×10-3 0.5×10-3 1×10-3 1×10-3 4×10-3 0.5×10-3 2×10-3
乙醇提取物组 >128 >128 64 >128 32 128 >128 >128 >128 >128
乙酸乙酯提取物组 >128 >128 >128 >128 4 32 64 >128 >128 >128
正丁醇提取物组 >128 >128 >128 >128 >128 >128 >128 >128 64 >128
水溶物组 >128 >128 >128 >128 4 64 64 >128 128 >128

表4 牛舌草提取物对5种菌株MIC和MBC结果

Tab.4 MIC and MBC of extracts of Anchusa italica Retz. on five strains mg·mL-1

3 讨论

本实验采用经典的角叉菜胶致大鼠足趾肿胀模型评价意大利牛舌草各提取部位的抗炎药理活性。在模型建立过程中,模型对照组大鼠足趾肿胀度较空白对照组显著增加,表明大鼠足趾肿胀模型造模成功,致炎后大鼠足趾发生炎症,肿胀度随时间发生相应的变化。致炎0.5 h后,空白对照组与模型对照组肿胀度值达到高峰,0.5~2 h内,肿胀度值变化较小,而在4 h后两组的肿胀度值均开始回落,空白对照组在6 h后肿胀逐渐恢复正常,模型对照组值在6 h后回落明显,考虑与角叉菜胶所致机体的急性炎症反应有关,此结果与国内相关报道接近[12]。

本研究显示,意大利牛舌草乙醇提取部位(0.63,2.52 g·kg-1)在致炎后2 h抑制大鼠足趾肿胀程度显著(P<0.01),2.52 g·kg-1剂量组在致炎4 h内抑制炎症作用与醋酸地塞米松组作用相当,正丁醇部位与乙醇部位的抑制炎症效果差异无统计学意义,提示乙醇粗提取部位及正丁醇部位具有抗炎活性;小鼠镇咳实验反应,乙醇提取物组(3.04,0.90 g·kg-1)与正丁醇部位组(3.04 g·kg-1)延长小鼠咳嗽潜伏期作用与急支糖浆组作用相当(P<0.05或P<0.01),并且乙醇提取部位、正丁醇部位3.04 g·kg-1剂量组咳嗽次数明显减少(P<0.05),此结果提示意大利牛舌草乙醇提取部位、正丁醇部位均具有镇咳作用;二倍试管稀释法筛选不同提取物的抑菌活性实验显示,4种意大利牛舌草提取物分别对枯草芽孢杆菌具有抑菌活性,其中乙酸乙酯部位与水溶部位的抑制水平较其他部位明显。

本研究表明,意大利牛舌草乙醇粗提物具有抗炎、镇咳的药理活性,其正丁醇部位的活性较其他部位明显,并且与乙醇粗提取物的作用相当,在有效物质提取富集方面,正丁醇部位的提取率均高于其他极性部位,提示意大利牛舌草提取物在抗炎、镇咳方面显现出药理活性,值得深入研究。

The authors have declared that no competing interests exist.
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意大利牛舌草
抗炎作用
镇咳作用
抑菌作用
Retz.
Anti-inflammatory activit...
Antitussive effects
Bacteriostatic action
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徐晓琴
陈良
张娟
孙宇
卿德刚
倪慧
XU Xiaoqin
CHEN Liang
ZHANG Juan
SUN Yu
QING Degang
NI Hui