目的 建立去溶剂法制备半乳糖介导的姜黄素白蛋白纳米粒,并考察其理化性质及体外释药特性。方法 以半乳糖修饰的牛血清白蛋白作为载体材料,姜黄素作为模型药物,采用去溶剂法制备姜黄素半乳糖化白蛋白纳米粒,单因素考察优化处方工艺,采用激光纳米粒度仪对其粒径和Zeta电位进行测定;超速离心法测定包封率及载药量;透析法考察其体外释药特性。结果 根据优化处方工艺制备的白蛋白纳米粒外观呈圆形或类圆形,粒径分布为(267.1±78.3) nm,Zeta电位为-40~-50 mV;包封率为79.4%,载药量为3.7%;姜黄素纳米粒在 8 h释药量为20%,48 h释药量>80%。结论 去溶剂法制备的姜黄素纳米粒具有良好的理化性质和释药性能,提高药物的稳定性,可显著提高药物释放速率,提高生物利用度。
Objective To prepare galactosylated bovine serum albumin nanoparticles (Gal-BSA NPs) of curcumin by desolvation method, and to investigate its physicochemical properties and
白蛋白是一种内源性生物大分子材料,具有无毒性、生物可降解性、无免疫原性及在生物体内可代谢为无害的代谢产物等特点[12]。白蛋白纳米载体材料主要有牛血白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、卵白蛋白(ovalbumin,OVA)及人血白蛋白(human serum albumin,HSA)等。其中BSA来源丰富、价格低廉且易于纯化等被广泛用于制备白蛋白纳米载药系统。BSA分子中含有的氨基和羧基等功能基团可采用特定的配体对白蛋白纳米粒表面进行修饰,半乳糖修饰的牛血清白蛋白(Gal-BSA)可实现荷载药物肝靶向[13]。笔者在本研究通过BSA结构中氨基和乳糖酸结构中羧基进行酰胺化反应合成Gal-BSA,以姜黄素为模型药物,Gal-BSA为载体材料,采用去溶剂化法制备半乳糖修饰的姜黄素白蛋白纳米粒(Gal-BSA NPs),并考察纳米粒的形态、粒径分布、Zeta电位、包封率、载药量、体外释放等。报道如下。
EL104电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司,感量:0.1 mg),FTIR-8400s傅立叶红外光谱仪(日本岛津公司),PSS 380ZLS激光纳米粒度/电位仪(美国Particle Size Sytem公司),透射电子显微镜(H-600,日本日立公司),UV-2450紫外分光光度仪(日本岛津公司),KQ-500型超声波清洗器(昆山市超声仪有限公司),SHZ-B旋转气浴恒温振荡器(金坛市金分仪器有限责任公司),FEI Tecnai G2T12透射电镜仪(美国FEI公司),25L冷冻干燥机(美国LABCONCO公司),85-1恒温磁力搅拌器(国华仪器公司),TGL-16C高速离心机(上海安亭科学仪器厂),透析袋(截留相对分子质量为2 000和12 000)。
姜黄素对照品(中国食品药品检定研究院,含量>99%,批号:150324),姜黄素原料(郑州荔诺生物制品有限公司,含量>98%,批号:20140912),牛血清白蛋白(上海国药试剂公司,含量>96%,批号:20150322),乳糖酸(上海国药试剂公司,含量≥98.0%,批号:20150218),
将乳糖酸适量(220 mg)溶解于MES溶液10 mL中,用0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液调pH值至5。加入EDC 220 mg和NHS 110 mg,活化反应30 min。然后用0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液调pH值至8,将BSA160 mg加入上述溶液,500 r·min-1搅拌反应48 h,让乳糖酸交联到白蛋白分子表面。所得溶液在透析袋(截留相对分子质量12 000)中透析3 d,每天换水3次,冷冻干燥得Gal-BSA。
取适量的Gal-BSA、BSA及乳糖酸样品,分别与溴化钾(KBr)粉末经混匀、研磨、压片。FTIR-8400S测定各样品的红外光谱。见
采用去溶剂法[14]制备BSA NPs,称取BSA40 mg溶于10 mmol·L-1 氯化钠溶液2 mL,0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH值至8~9,取适量的姜黄素溶于乙醇1 mL,以0.7~1.0 mL·min-1在磁力搅拌500~600 r·min-1下滴加,按试验设计量滴加剩余乙醇,后加入8%戊二醛60 μL,交联搅拌24 h,即得黄色BSA NPs的乳状液。
Gal-BSA NPs的制备与BSA NPs制备相似,取GAL-BSA40 mg溶于10 mmol·L-1 氯化钠溶液2 mL,0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH值至8~9,取适量的姜黄素溶于乙醇1 mL,以0.7~1.0 mL·min-1在磁力搅拌500~600 r·min-1下滴加,按试验设计量滴加剩余乙醇,后加入8%戊二醛60 μL,交联搅拌24 h,即得黄色的Gal-BSA NPs乳状液。
2.4.1 姜黄素紫外标准曲线的建立 精密称取姜黄素对照品5 mg,乙醇溶解并定容到50 mL量瓶中,得100 mg·L-1的储备液,分别吸取0.05,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8 mL的储备液置于10 mL量瓶中,乙醇定容,配制浓度为0.5,1,2,4,6,8 mg·L-1的标准溶液,在波长426 nm处测定吸光度(
2.4.2 Gal-BSA NPs包封率和载药量的测定 精密移取一定量的Gal-BSA NPs胶体溶液,在12 000 r·min-1下超速离心15 min,精密移取上清液0.5 mL,用乙醇定容至10 mL量瓶,于波长426 nm处测定
包封率(entrapment efficiency,EE)、载药量(drug loading,DL)计算公式如下:EE(%)=(
为了更好地优化Gal-BSA NPs的制备工艺,考察Gal-BSA浓度、乙醇滴加体积、pH值等影响因素,见
BSA纳米颗粒2 mL高速离心后,重新分散在0.1 mol·L-1碳酸氢钠盐缓冲液(pH 值8.5)2 mL中,形成浓度约为0.5 mg·mL-1溶液,移取分散液2 mL,加入0.01%的TNBS水溶液1 mL,混合溶液在37 ℃下500 r·min-1反应2 h,12 000 r·min-1离心20 min,取上清液用分光光度计在波长345 nm处测定未反应的TNBS。
乳糖酸修饰的BSA纳米颗粒2 mL,高速离心后重新分散0.1 mol·L-1碳酸氢钠盐缓冲液(pH 值8.5)2 mL中。游离氨基修饰的BSA纳米颗粒含量用上述TNBS方法进行测定。通过对半乳糖化后所得到的量与原来游离氨基的量的比较,半乳糖化过程的效率通过半乳糖化的氨基基团的比例计算。
无乳糖酸修饰的BSA用TNBS显色法测得的
将纳米粒悬液滴加至载有碳膜的铜网上,滤纸吸干液体,室温下自然干燥,透射电镜观察其形态,结果见
采用NicompTM380/ZLS型电势及粒度测定仪测定Gal-BSA NPs的粒径和Zeta电势。粒径测定参数如下:He-Ne激光(波长635 nm),折光率和黏度分别为
采用动态透析法[15,16,17]考察载药纳米粒的缓释性能。称取适量纳米粒(含姜黄素约1.5 mg)重新分散在含1%聚山梨酯80的PBS缓冲液(pH值5.9)10 mL中,精密移取溶液7 mL,装入经过处理的透析袋(截留相对分子质量12 000)中,两端用透析袋夹紧,置于含1%聚山梨酯80的PBS缓冲液(pH值5.9)200 mL中,恒温摇床上震荡,控制温度(37.0±0.5)℃,转速80~100 r·min-1,分别于0.25,0.5,1,3,6,9,12,24,36,48 h,取释放液4 mL,紫外分光光度法测定姜黄素的含量,并迅速补充含1%聚山梨酯80的PBS缓冲液(pH值5.9)4 mL。样品以含1%聚山梨酯80的PBS缓冲液(pH值5.9)为空白对照,波长426 nm处测定吸光度计算姜黄素含量。取3次实验的平均值,以释药量对时间作图,绘制载药纳米粒的释放曲线。结果见图3。由图3知,Cur原料药在释放介质中释放较快,8 h的释放量近100%;而Gal-BSA NPs在 8 h释药量为20%,在48 h释药量>80%,具有明显缓释特征。
分别按零级、一级、Higuchi方程对姜黄素纳米粒体外释药行为进行拟合,得到拟合方程及相关系数,见
本研究以姜黄素作为模型药物,选择半乳糖修饰的牛血清白蛋白作为载体材料,采用去溶剂法制备姜黄素半乳糖化白蛋白纳米粒,单因素考察优化处方工艺。本实验制备的纳米粒具有良好的外观形态、粒径分布,提高荷载药物稳定性和溶解度,延长药物释放速率。
制备工艺优化实验中主要以纳米粒的外观形态、粒径分布和包封率为主要考察指标。选择去溶剂法制备纳米粒,考察载体浓度、乙醇滴加体积、pH值等影响因素,此外,还考察了乙酸乙酯、丙酮等去溶剂对纳米粒形成的影响,最后选择乙醇作为最终的去溶剂,体外溶出实验中,由于姜黄素在水中的溶解度较低,为了模拟制剂在体内的释放行为,本实验以含1%聚山梨酯80的PBS缓冲液(pH 值5.91)为释放介质,符合漏槽条件,同时姜黄素在该实验条件下稳定性较好。
The authors have declared that no competing interests exist.
[1] |
Curcumin (diferuloyl), from the Indian spice turmeric, reduces oxidative damage and induces apoptosis. Utilizing DNA microarrays, we have demonstrated that a low (5 M) dose of curcumin added to a mixture of astrocytes and oligodendrocytes (C6 rat glioma cells) in culture for 24 and 48 h significantly modulates gene expression in four primary pathways: oxidative stress, cell cycle control, and DNA transcription and metabolism. Contribution of the pentose phosphate pathway to the pool of NADH upregulates glutathione and activates aldehyde oxidase. We have identified also several new genes, up- or downregulated by curcumin, namely, aldo-keto reductase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, and aldehyde oxidase that protect against oxidative stress. The identification of several new cell cycle control genes, including the apoptosis-related protein (pirin) and insulin-like growth factor (IGF), and of the neurofilament M protein involved in neurogenesis suggests that curcumin may have applicability in the treatment of a spectrum of neurodegenerative diseases.
DOI:10.1007/s11064-008-9608-x
PMID:1829998062
[本文引用:1]
|
[2] |
|
[3] |
|
[4] |
|
[5] |
|
[6] |
|
[7] |
|
[8] |
|
[9] |
目的考察在三元体系中各条件下的平衡状态,计算姜黄素共晶的相关热力学常数,探讨无水乙醇作为特异性溶剂的合理性。方法采用溶液法分别测定姜黄素在不同温度下、不同浓度赖氨酸的无水乙醇中的溶解度,通过数学推导,得出姜黄素共晶的热力学常数。结果绘制了姜黄素-赖氨酸-无水乙醇的三元相图,并求得了K_(sp)、K_(ll)、△G°、△H及△S等热力学参数。结论无水乙醇可以作为特异性溶剂用于提取姜黄素共晶中混杂的姜黄素单体。
[本文引用:1]
|
[10] |
|
[11] |
|
[12] |
|
[13] |
|
[10] |
|
[11] |
|
[12] |
|
[13] |
|
[14] |
|