目的 研究绿原酸(CGA)对脂多糖(LPS)诱导的急性肾损伤(AKI)小鼠的保护作用及其作用机制。方法 将50只小鼠随机分成对照组、LPS组、LPS+CGA不同剂量(5,10,20 mg·kg-1)组,每组10只。对照组腹腔注射磷酸盐缓冲液(PBS)20 mL·kg-1;LPS组腹腔注射LPS溶液10 mg·kg-1;LPS+CGA各剂量组给予LPS 1 h后腹腔注射0.9%氯化钠溶液配制的CGA溶液。24 h后采集小鼠血液和肾组织,行组织病理学检查,测定血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN),并进行肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-1β、蛋白质印迹分析。结果 CGA可呈剂量依赖性地抑制肾组织病理改变、血清BUN和Scr水平,与LPS组比较,均差异有统计学意义(
Objective To investigate the protective effect and mechanism of chlorogenic acid on lipopolysaccharide (LPS)-induced acute kidney injury (AKI) of mice. Methods Fifty mice were randomly divided into 5 different groups (10 in each group): control group, LPS group, and 3 groups of LPS+CGA in different doses (5, 10 and 20 mg·kg-1).The control group received intraperitoneal injection of PBS 20 mL·kg-1; LPS group received intraperitoneal injection of LPS solution 10 mg·kg-1; and LPS+CGA group received LPS as above and intraperitoneal injection of CGA in 0.9% sodium chloride solution.After 24 hours, the blood and kidney tissues of the mice were collected for histopathological examination and biochemical assays to determine the changes of serum creatinine (Scr), urea nitrogen (BUN), tumor necrosis factor (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), IL-1β and TLR4/NF-κB signaling pathway. Results Chlorogenic acid inhibited LPS-induced renal histopathological changes, serum BUN and creatinine levels in a dose-dependent manner, the differences were statistically significant (
脓毒症是一种常见、复杂且致命的感染并发症,通常由免疫反应释放大量的炎性细胞因子引起[1]。急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是脓毒症的严重并发症,有研究发现其由脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)所致[2]。脂多糖诱导疾病模型是阐明脓毒症AKI机制和潜在治疗方法的常用动物模型之一。脂多糖可诱导TLR4信号通路,进而诱导核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)活化和炎性细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和白细胞介素-1β(interleukin -1β,IL-1β)[3]。这些炎症细胞因子可能导致肾损伤,使肾小球中性粒细胞浸润和单核细胞转移,特别是肾小球系膜周围区域[4]。因此,通过抑制炎症细胞因子产生可以有效治疗肾损伤。据报道,植物多酚对多种炎症性疾病有抗氧化和抗炎作用[5],其抗氧化和抗自由基性能作用于酶活化、基因表达、信号转导途径,进而阻止或延迟炎症性疾病发生。已有研究表明,多酚可以分解2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]自由基,清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基、羟自由基和超氧自由基,抑制低密度脂蛋白(low-densitylipoprotein,LDL)氧化,螯合铜离子,还原铁离子[6,7]。绿原酸(chlorogenic acid,CGA)是最常见的多酚之一,具有多重药理活性、强效免疫保护、抗炎、抗菌和抗氧化特性[8]。此外,有研究发现绿原酸具有预防脂多糖诱导小鼠急性肺损伤的作用[9]。研究发现,绿原酸可以减轻链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病大鼠的肾损伤。但绿原酸对脂多糖诱导AKI的保护作用报道较少见。笔者在本研究中探讨绿原酸对脂多糖诱导小鼠AKI的治疗作用。
绿原酸购自中国食品药品检定研究院(批号:110753-201415,含量≥98%);脂多糖(批号:L-2880)、磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline,PBS,批号:P5368)购自Sigma 公司;血肌酐( serum creatinine,Scr,批号:T17P128B)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN,批号:EIABUN)、TNF-α(批号:168235001)、IL-6(批号:146735017)和IL-1β 酶联免疫吸附测定(ELISA)(批号:147442015)试剂盒均购自eBioscience 公司;增强化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)试剂购自Milipore公司(批号:WBKLS0100);细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(批号:P0028)、多功能电泳仪(型号:EEP102)购自中国碧云天生物技术有限公司;连续光谱扫描式酶标仪(型号:SpectraMax Plus384)购自美谷分子仪器有限公司。
无特定病原体级(SPF)雌性C57BL/6小鼠,6~8周龄,体质量18~22 g,购于维通利华实验动物技术有限公司,动物生产许可证号:SCXK(京)2016-0006,置于温度(22±2)℃,相对湿度50%~60%,12 h循环照明的环境中适应性饲养7 d,自由摄食和饮水。
采用随机数字表法将50只小鼠随机分成5组,每组10只:对照组、LPS组、LPS+CGA不同剂量(5,10,20 mg·kg-1)组。LPS组腹腔注射LPS溶液10 mg·kg-1;LPS+CGA组给予LPS1 h后腹腔注射0.9%氯化钠溶液配制的绿原酸溶液。对照组腹腔注射PBS 20 mL·kg-1。在LPS刺激后24 h,处死小鼠并采集血液和肾组织。
10%甲醛固定肾组织并切片,石蜡包埋,苏木精-伊红(HE)染色,光学显微镜下观察肾组织病理变化。采用Jablonski半定量评分标准评价肾损伤程度[10],0分为正常组织;肾小管损伤面积<5%为1 分;5%~25%为2 分;>25%~75%为3 分;> 75%为4 分。
按照试剂盒说明书检测Scr和BUN。
根据说明书,采用ELISA试剂盒测定小鼠血清和肾组织TNF-α、IL-6和IL-1β水平。
使用细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒提取肾脏组织蛋白质。12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分离总蛋白样品(30 μg),转移到聚偏氟乙烯膜。室温下5%脱脂乳封闭2 h,将封闭的膜与抗Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)(1:1000),髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)(1:1000),核因子κBp65(nuclear factor kappa-Bp65,NF-κBp65)(1:1000),磷酸化核因子κB抑制蛋白(phospho-inhibitor ofNF-κB,p-IκB)(1:1000),核因子κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,IκB)(1:1000)和β-肌动蛋白(β-actin)(1:2000)一抗4 ℃孵育过夜。将膜与二次抗体室温孵育1 h,ECL试剂显现免疫反应条带。
采用SPSS 12.0版统计软件进行统计分析,所有数据均用3个独立实验的均值±标准差(
见
与对照组比较,LPS组血清Scr和BUN显著升高(
与对照组比较,LPS组血清和肾脏TNF-α、IL-6和IL-1β显著增加(
AKI常伴有严重并发症,直接影响其他系统,并导致危重患者多器官功能衰竭[11]。严重并发症导致AKI患者死亡率达到30% [12]。因此迫切需要探索新的治疗途径。绿原酸广泛存在于中草药,具有很强的抗炎作用[13]。本实验中,与对照组比较,LPS组肾组织病理学及血清生化指标有明显差异,肾小球结构被破坏,肾小管上皮细胞变性,肾小管和肾间质细胞存在严重的细胞内灌流和充血。此外,LPS组血Scr和BUN水平升高,肾功能不全。给予不同剂量绿原酸后,小鼠肾组织病理学变化减轻,血BUN和Scr水平降低。提示绿原酸可减轻脂多糖诱导的AKI。
脂多糖是导致脓毒症或AKI的关键因素[14]。据报道,脂多糖所致炎症细胞因子在AKI发病机制中发挥重要作用[15]。在脂多糖诱导AKI过程中,TNF-α、IL-1β和IL-6在血清和肾组织升高,脂多糖能诱导AKI发病相关炎症细胞因子产生。越来越多的证据表明,抑制上述细胞因子可减轻AKI [16]。本研究结果表明,绿原酸呈剂量依赖性地抑制脂多糖诱导的TNF-α、IL-1β和IL-6产生,抑制这些炎症细胞因子的释放是绿原酸对脂多糖诱导AKI的保护机制。
为进一步研究绿原酸抑制炎症细胞因子产生的机制,本研究探索了绿原酸对TLR4/NF-κB信号通路活化的影响,该通路被认为是肾脏炎症主要因素。脂多糖所致TLR4活化通过诱导炎症细胞因子产生而传导初期损伤,与引发炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达相关的NF-κB信号通路密切相关,已有证据表明减少TLR4和NF-κB介导的炎症反应在各器官中有抵抗AKI的保护作用。
笔者在本实验采用脂多糖诱导小鼠模型,研究绿原酸对AKI的保护机制,结果表明绿原酸可呈剂量依赖性地抑制磷酸化IκB的表达和NF-κB p65活性。此外,Western bloting分析研究MyD88和TLR4在肾组织中的表达,发现脂多糖刺激导致MyD88和TLR4的显著表达,而绿原酸可减弱MyD88和TLR4的活化。
实验结果表明,绿原酸可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的活化来减少脂多糖诱导AKI的促炎症细胞因子。
The authors have declared that no competing interests exist.