目的 采用正交实验设计,优选白芥子涂方药材提取工艺和乳化型膏贴基质配比。方法 分别以白芥子中芥子碱硫氰酸盐、甘遂中大戟二烯醇提取量,以及延胡素中延胡索乙素、细辛中细辛酯素提取量作为考察指标,选择L9(34)正交实验,考察各因素对乙醇回流提取工艺和超临界二氧化碳(CO2)萃取工艺的影响。选用石蜡、单甘酯、凡士林、甘油为乳化型膏贴基质配料,选择黏性、软硬度、熔化性、均匀度为考察指标进行综合评分,采用L9(34)正交实验优选基质配制比例。结果 回流提取过程中,乙醇浓度对白芥子和甘遂提取均有显著影响(
Objective To optimize the extraction process of white mustard seed varnish and it's matrix ratio by orthogonal design. Methods The extraction process was optimized by L9(34)orthogonal design with the yield of extraction of sinapine thiocyanate,euphadienol,tetrahydropalmatine, and asarinin.The variance analysis method was used to find out the key factors on ethanol reflux extraction and supercritical CO2 extraction process.Paste substrate consists of paraffin, monoglyceride,vaseline,glycerin and so on.The research selected viscosity, hardness,melting property and evenness as indicators to evaluate the formulations.And the L9 (34) orthogonal experiment was used to select the optimal formulation. Results Ethanol concentration significantly affected the extraction of white mustard and
白芥子涂方用于防治肺系疾病,始见于清代张璐编撰的《张氏医通》,该方在防治哮喘方面有较好疗效,目前被各大医院广泛采用[1]。传统白芥子涂方以药材粉末入药,不仅成分含量不可控,且由于药材本身质量差异以及患者皮肤耐受程度差别,使得贴敷时间一般只能维持2~6 h[2,3],有悖于经皮给药制剂质量可控、缓释长效的要求。目前,笔者尚未见基于该方开发的现代膏贴剂型。笔者在系统比较软膏剂、黑膏药等膏贴剂型特点基础上,配制具有乳化性质的硬膏剂基质。该基质与其他外用膏贴基质相比,在载药量、乳化性能、药物兼容性、透皮能力、稳定性方面均具有明显优势。笔者在研究中首先采用乙醇回流提取与现代超临界二氧化碳(CO2)萃取技术实现药材有效成分的浓度富集与纯化,再结合乳化型膏贴透皮剂型,将此传统经典方药开发成治疗哮喘的新型中药膏贴剂型,现报道如下。
SPD-10A型二元泵高效液相色谱仪,配Essentia SPD-16型紫外检测器(岛津公司); ME215s型分析天平(Sartorious公司,感量:0.01 mg);HS6510D型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
芥子碱硫氰酸盐对照品(批号:111702-201303,含量:98.3%)、大戟二烯醇对照品(批号:111866-201302,含量:99.9%)、细辛酯素对照品(批号:111889-201203,含量:100%)、延胡索乙素对照品(批号:0726-200208,含量:99.8%)均购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯(美国Tedia试剂公司生产,批号:16095012)。水为纯净水,其他试剂均为市售分析纯。
2.1.1 芥子碱硫氰酸盐含量测定色谱条件 色谱柱:Zorbax Extend C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈-0.08 mol·L-1磷酸二氢钾(10:90);流速:1.0 mL·min-1;检测波长:326 nm;进样量:10 μL;柱温:30 ℃,理论塔板数按芥子碱峰计算应不低于3000。
2.1.2 大戟二烯醇含量测定色谱条件 色谱柱:Zorbax Extend C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈-水(95:5);流速:1.0 mL·min-1;检测波长:210 nm;进样量:10 μL;柱温:30 ℃,理论板数按大戟二烯醇峰计算应不低于6000。
2.1.3 细辛脂素测定色谱条件 色谱柱:Zorbax Extend C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈-0.2%醋酸溶液(48:52);流速:1.0 mL·min-1;检测波长:287 nm;进样量:10 μL;柱温:室温,理论板数按细辛脂素峰计算应不低于3000[4]。
2.1.4 延胡索乙素测定色谱条件 色谱柱:Zorbax Extend C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液(40:60),用三乙胺调pH值6.5;流速:1.0 mL·min-1;检测波长:280 nm;进样量:10 μL;柱温:30 ℃,理论板数按延胡索乙素峰计算应不低于3000[5]。
2.2.1 对照品贮备溶液的制备 精密称取经五氧化二磷干燥至恒重的芥子碱硫氰酸盐对照品、大戟二烯醇对照品各适量,分别置于不同量瓶,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,分别制成芥子碱硫氰酸盐496 μg·mL-1和大戟二烯醇163 μg·mL-1对照品贮备溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取各回流提取样品1 mL,甲醇定容至5 mL量瓶,摇匀,以孔径0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
2.2.3 阴性对照溶液的制备 取除受试药材以外的药材,按回流提取方法操作,精密量取提取液样品1 mL,甲醇定容至5 mL量瓶,摇匀,以孔径0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即为阴性对照溶液。
2.3.1 方法专属性考察 吸取供试品溶液、阴性对照溶液、芥子碱硫氰酸盐和大戟二烯醇对照品溶液各10 μL,按“2.1”项色谱条件进行液相分析,见
2.3.2 标准曲线的绘制 精密量取上述对照品贮备溶液100,200,400,1000,2000 μL,加甲醇稀释定容至10 mL,分别精密吸取10 μL注入液相色谱仪,按照上述色谱条件平行进样测定3次。以芥子碱硫氰酸盐、大戟二烯醇进样量(ng)为横坐标(
2.3.3 精密度实验 精密吸取同一供试品溶液10 μL,按“2.1”项色谱条件连续进样5次,测得芥子碱硫氰酸盐和大戟二烯醇峰面积的RSD分别为0.28%和0.93%,表明仪器精密度良好。
2.3.4 稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液10 μL,分别于0,2,4,6,12 h进样测定。经计算,芥子碱硫氰酸盐和大戟二烯醇峰面积的RSD分别为1.12%和1.57%,表明供试品溶液在12 h内基本保持稳定。
2.3.5 回收率实验 精密称取9份已知含量的回流提取液200 μL,分别向其中加入一定量芥子碱硫氰酸盐或大戟二烯醇对照品,用流动相加至5 mL,混匀,精密吸取10 μL注入液相色谱仪,测定峰面积。利用标准曲线计算含量,以3次平行进样的平均含量计算加样回收率,结果芥子碱硫氰酸盐平均回收率97.06%,RSD=2.40%,大戟二烯醇平均回收费率96.66%,RSD=2.31%。见
白芥子、甘遂药材乙醇回流提取工艺,以白芥子有效成分芥子碱硫氰酸盐和甘遂有效成分大戟二烯醇的提取量作为考察指标,采用《中华人民共和国药典》2015年版芥子和甘遂药材品种项下高效液相色谱(HPLC)法测定相关指标成分含量[5]。以乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数为影响因素,选用L9(34)表进行正交实验,优选回流提取工艺条件。正交实验因素水平设计见
细辛和延胡索超临界CO2萃取工艺是以延胡索中延胡索乙素以及细辛中细辛酯素提取量为考察指标,采用《中华人民共和国药典》2015年版细辛和延胡索药材品种项下HPLC法测定相关指标成分含量[5]。以萃取压力、萃取温度、夹带剂用量、萃取时间为影响因素,选用L9(34)表进行正交实验,优选超临界CO2萃取工艺条件。正交实验因素水平设计见
成型工艺采用石蜡、单甘酯、凡士林、甘油为中药膏贴剂型基质配料,选择黏性、软硬度、熔化性、均匀度等为考察指标进行综合评分,采用L9(34)正交实验优选基质配制比例,正交实验因素水平设计见
按膏贴基质配比正交实验设计表实验,将制成的药膏制成圆柱状,再切成圆片状,将药膏填充入背衬层的固定圆环中,使每张膏贴中填充药膏2 g,直径约3.6 cm,含生药材4 g。以下是正交实验基质评分的标准。①黏性。4分:适中,不粘手;2分:黏性偏强或偏差;0分:无黏性或粘手。②软硬度。4分:适中,易成形,易压成片状;2分:较易成形,但偏硬或偏软;0分:太硬或太软,不易成形。③均匀度(肉眼观察)。4分:颜色均匀一致;2分:比较均匀,但浸膏与基质混合略显不均匀;0分:浸膏与基质混合不均匀。④熔化性(45~50 ℃考察48 h)。4分:制成贴剂后,放置恒温45~50 ℃烘箱中观察48 h,基质不熔化,底衬垫上未见明显熔化痕迹<1 mm;2分:基质少量熔化,底衬垫上熔化痕迹1~2.5 mm;0分:基质熔化明显,底衬垫上熔化痕迹>2.5 mm。⑤载药量。4分:20%以上;3分:15~20%;2分:10~15%;1分:10%以下。
按
结果显示,仅乙醇浓度对白芥子和甘遂提取效果产生显著影响(
按
以细辛脂素含量为评价指标,由直观分析极差
乳化型膏贴基质配比的正交实验结果见
由
白芥子涂方穴位敷贴以原粉入药,不仅有效成分含量低,而且不利于质量控制,笔者在本研究采用超临界CO2萃取技术对目标成分进行选择性高效提取[4],并采用HPLC法对其含量进行控制,制备出具有乳化性质的硬膏剂型。该剂型与其他外用膏贴剂相比在载药量、熔化性、均匀性、乳化性能、透皮性能方面具有显著特点,同时体外经皮渗透实验验证了超临界CO2萃取技术应用于经皮给药制剂脂溶性有效成分提取的可行性与合理性,为进一步研究指标成分透皮行为奠定基础。
The authors have declared that no competing interests exist.