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医药导报
医药导报, 2022, 41(9): 1282-1288
doi: 10.3870/j.issn.1004-0781.2022.09.006
苦杏仁苷对肾纤维化大鼠的保护作用及其机制*
Protective Effect and Mechanism of Amygdalin on Renal Fibrosis in Rats
李想1,, 刘庆1, 高晨1, 周红兵1, 常虹1, 王佳1, 白万富1,, 石松利1,2,
1.包头医学院 药学院,包头 014060
2.包头医学院 蒙中药活性物质与功能研究所,包头 014060
LI Xiang1,, LIU Qing1, GAO Chen1, ZHOU Hongbing1, CHANG Hong1, WANG Jia1, BAI Wanfu1,, SHI Songli1,2,
1. School of Pharmacy,Baotou Medical College,Baotou 014060,China
2. Institute of Bioactive Substance and Function of Mongolian Medicine and Chinese Materia Medica,Baotou Medical College,Baotou 014060,China
通信作者 石松利(1981-),女,河南洛阳人,教授,博士,研究方向:中蒙药药理及化学成分。E-mail: shisongli122@126.com。白万富(1982-),男,内蒙古包头人,副教授,博士,研究方向:中蒙药作用机制及新药开发。E-mail: bwf007007@sina.com。

作者简介 李想(1995-),女,河北保定人,在读硕士,研究方向:中蒙药药理及化学成分。ORCID:0000-0002-3341-7190,E-mail: lixiang15232282834@163.com。

基金资助: 国家自然科学基金资助项目(81641137,81760782)
中图分类号: R282.71;R285     文献标识码: A     文章编号: 1004-0781(2022)09-1282-08
摘要:

目的 探讨蒙古扁桃苦杏仁苷对肾纤维化大鼠的作用及其机制。 方法 SD雄性大鼠 60只,按体质量随机分为6组:假手术组、模型对照组、贝那普利组和苦杏仁苷小、中、大剂量组,每组10只。除假手术组外其余各组大鼠均采用左侧输尿管梗阻方法造模。连续灌胃给药21 d后处死,记录大鼠24 h尿量、计算大鼠肾脏脏器系数;测定大鼠血清中尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、白蛋白(ALB)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量及组织中 SOD、MDA、羟脯胺酸(HYP) 含量;荧光定量聚合酶链反应(PCR) 法检测组织内转化生成因子 β1(TGF-β1)、Smad3、Smad7 mRNA的表达;采用苏木精-伊红(HE)和马松(Masson)染色观察左侧肾脏组织病理变化。 结果 与假手术组比较,模型对照组大鼠尿量显著减少(P<0.01),血清和组织SOD活力显著降低(P<0.01),肾脏脏器系数、BUN、Scr、ALB水平及血清和组织MDA含量、组织HYP含量显著升高(P<0.01);TGF-β1、Smad3 mRNA表达量显著升高,Smad7 mRNA表达量显著降低(P<0.01)。与模型对照组比较,苦杏仁苷给药组肾间质及肾小管损伤情况显著改善,纤维化程度显著降低(P<0.01),24 h尿量显著增加(P<0.01),脏器系数显著降低(P<0.01),其中以小剂量组效果最显著;苦杏仁苷小剂量组BUN、Scr、ALB水平、血清和组织MDA含量及HYP含量(P<0.01)均显著降低,血清SOD活力显著升高(P<0.01),TGF-β1、Smad3 mRNA的表达显著下调(P<0.01),Smad7 mRNA的表达(P<0.01)显著上调;苦杏仁苷中剂量组Scr水平、ALB水平、血清和组织MDA含量及HYP含量均显著降低(P<0.01),组织SOD活力显著升高(P<0.01);苦杏仁苷大剂量组血清和组织MDA含量均显著降低(P<0.01)。 结论 苦杏仁苷对肾纤维化大鼠肾脏具有良好的保护作用,能提高机体抗氧化能力,以小剂量作用效果最好,其作用机制可能是干预TGF-β1/Smad信号通路。

关键词: 苦杏仁苷; 蒙古扁桃; 肾纤维化; TGF-β/Smad信号通路

Abstract:

Objective To investigate the effect and its possible mechanism of amygdalin(AMY) on renal fibrosis rats. Methods A total of 60 male SD rats were randomly divided into sham operated group(SDG),model control group(MOD),benazepril hydrochloride tablets group(BHT),and amygdalin low-,medium-,high-dose groups(AMY-L,AMY-M,AMY-H).Renal fibrosis model was prepared by unilateral ureteral obstruction.After 21 days of continuous intragastric administration,the rats were sacrificed,the 24 h urine output was recorded,and the renal viscera coefficients were calculated;Blood urea nitrogen(BUN),serum creatinine(Scr),albumin(ALB),superoxide dismutase(SOD),malondialdehyde(MDA) in serum and the content of SOD,MDA,and hydroxyproline(HYP) in the tissue were detected.Quantitative polymerase chain reaction(qPCR) method was used to detect transforming growth factor β1(TGF-β1),Smad3,Smad7 mRNA expression level in the kidney.The hematoxylin-eosin(HE) and Masson staining was used to observe the histopathological changes in the kidney tissue. Results Compared with the SDG,the urine output was significantly reduced(P<0.01),the SOD activity of serum and tissue was significantly reduced(P<0.01),the renal viscera coefficients,the levels of BUN,Scr,ALB,and the MDA content of serum and tissue,and the HYP content of tissue increased significantly(P<0.01) in the MOD group. The expressions levels of TGF-β1,Smad3 mRNA in the tissue were significantly increased,and Smad7 mRNA was significantly reduced(P<0.01).Compared with the MOD group,the renal interstitial and renal tubular injury were alleviated significantly,the degree of fibrosis was significantly reduced(P<0.01),24-hour urine output was significantly increased(P<0.01),and renal viscera coefficients were significantly reduced(P<0.01) by the AMY,among which the AMY-L has the most significant effect. The BUN,Scr,ALB levels,MDA content of serum and tissue and HYP content were significantly reduced(P<0.01),SOD activity of serum was significantly increased(P<0.01),and the expressions of TGF-β1 and Smad3 mRNA were significantly down-regulated(P<0.01),the expressions of Smad7 mRNA was significantly up-regulated(P<0.01) in the AMY-L group. The Scr and ALB levels were significantly reduced(P<0.01),MDA content of serum and tissue and HYP content were significantly reduced(P<0.01),and SOD activity of tissue was significantly increased(P<0.01) in the AMY-M group. The MDA content of serum and tissue was significantly reduced(P<0.01) in the AMY-H group. Conclusion AMY has a good protective effect on the kidneys of renal fibrosis rats,and it can improve the body's antioxidant capacity.The effect of low dose AMY is better.The mechanism may be through the intervention of TGF-β1/Smad signaling.

Key words: Amygdalin; Amygdala mongolica; Renal fibrosis; Transforming growth factor β protein(TGF-β) / Smad signaling pathway

开放科学(资源服务)标识码(OSID)

肾纤维化是一种与肾功能恶化相关的慢性致命的纤维化肾脏疾病,也是各种终末期慢性肾病的常见表现形式,其特征为细胞外基质在肾小管和肾间质区异常和过度病理性沉积,使正常肾实质破坏、细胞功能障碍,逐渐形成瘢痕组织,造成肾组织渐进性和不可逆性破坏,导致肾功能不全,严重者会发生肾衰竭[1,2,3]。目前市售的药物,如血管紧张素转换酶抑制药(卡托普利)、血管紧张素Ⅱ受体阻断药和肾素抑制药,虽能够改善肾纤维化症状,但有严重的局限性[4,5]。与成分单一的西药比较,中药具有多成分、多靶点、多效应、不良反应小、疗效显著等特点,成为当下肾纤维化治疗药物的研究热点。

蒙古扁桃(Amygdalus mongolica),又名乌兰-布衣勒斯,主要分布在我国中西部的荒漠区和荒漠草原,如内蒙古、甘肃、宁夏和新疆[6],是戈壁荒漠特有物种[7],其种仁可代“郁李仁”入药[8],具利尿、润燥滑肠、止咳化痰之功[9]。本课题组前期对蒙古扁桃药材的化学成分及药理作用进行了基础研究,从种仁中分离得到了苦杏仁苷[10]、生物碱类[11]、黄酮类[12]、蛋白质类[13]、有机酸类[14]、多糖类[15]、脂肪酸和不饱和脂肪酸[16]等成分;药理作用研究结果显示,蒙古扁桃正丁醇提取物能够显著改善肝纤维化[17]、肺纤维化[18]和肾纤维化[19],提高高脂血症大鼠肝脏的抗氧化能力[20],还可明显改善肾小管间质损伤和纤维化,代谢组学研究发现与精氨酸和脯氨酸、组氨酸以及氨基糖和核苷酸糖等代谢途径相关[21]。本课题组前期采用色谱、波谱方法对蒙古扁桃药材正丁醇提取物进行化学成分研究,首次分离并鉴定得到苦杏仁苷单体化合物,比例为47.72%[10]。苦杏仁苷能显著提高超氧化物歧化酶(SOD)活力、降低丙二醛(MDA)的含量,起到保护肝脏的作用[22]。本实验采用单侧输尿管梗阻方法建立肾纤维化大鼠模型,对肾纤维化大鼠生理生化、肾功能指标及病理组织学和分子生物学结果进行分析,筛选苦杏仁苷对肾纤维化大鼠保护作用的有效剂量,并进一步探索其抗肾纤维化的作用机制,以期为寻找治疗肾纤维化有效药物提供科学依据。

1 材料与方法
1.1 实验动物

无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠 60只,体质量(190±20) g,购自北京大学医学部(实验动物科学部),生产许可证号:SCXK(京)2011-0012;饲养环境温度22~27 ℃,相对湿度(50±5)%。

1.2 药品与试剂

苦杏仁苷(上海纯优生物科技有限公司,批号:719B052,含量≥98%);盐酸贝那普利(北京诺华制药有限公司,批号:X2633,规格:每片10 mg);戊巴比妥钠(德国默克公司);注射用青霉素钠(华北制药股份有限公司,批号:F7116323);羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)试剂盒(批号:20180429)、SOD试剂盒(批号:20180503)、MDA试剂盒(批号:20180504),均购自南京建成生物研究所;苏木精-伊红(HE)试剂盒、马松(Masson)试剂盒(南京建成科技有限公司);mRNA提取试剂TRIzol(TIANGEN,批号:U8926)、逆转录试剂盒 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific公司,批号:00920948);实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,q-PCR) 试剂 RealSYBR Mixture(康为世纪公司,批号:30537);PCR引物(宁夏科诺嘉华生物工程有限公司)。

1.3 仪器与设备

RE-52型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);DZW-型水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂);TDZ4-WS低速自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司);CX31显微镜(日本奥林巴斯公司);MS-700研磨机(宁波美善美心电器有限公司);1510酶标仪(美国Thermo公司);Vlultifuge X1R低温高速离心机、NanoDrop 2000微量分光光度计(美国Thermo公司);温度梯度PCR仪、7500型qPCR仪(美国Applied Biosysterms)。

1.4 动物分组、模型制备、给药方法

SPF级SD雄性大鼠60只,按体质量随机分为假手术组,肾纤维化模型对照组,贝那普利组,苦杏仁苷小、中、大剂量组,每组10只。采用单侧输尿管梗阻方法制备肾纤维化大鼠模型[23],大鼠自购回适应性饲养1周后,称质量,麻醉,将麻醉大鼠仰卧位固定于鼠板上,手术区域脱毛备皮并用聚维酮碘消毒,沿大鼠左肋骨边缘下方1.5 cm处向外横切口2 cm,剪开外皮后分离腹膜,暴露左肾,分离出左侧输尿管后用手术缝合线进行结扎,结扎后再将肾脏回纳,逐层缝合大鼠皮毛组织,并消毒。假手术组大鼠进行同样手术,不结扎。造模第2天给药,模型对照组、假手术组灌注0.9%氯化钠溶液4 mL·kg-1,贝那普利组按1.5 mg·kg-1灌注盐酸贝那普利,苦杏仁苷小、中、大剂量组分别按20,40,80 mL·kg-1[22]灌胃给药,每天给药1次,连续给药21 d,给药期间大鼠自由进食进水。

1.5 样本采集

末次给药后眼眶静脉丛采血,血样以3500 r·min-1离心10 min(r=17.5 cm),吸取上层血清置液氮速冻后于-80 ℃冰箱保存备用;后将大鼠置于代谢笼中收集24 h尿量;取出大鼠称体质量,麻醉,固定,打开腹腔,腹主动脉取血后摘取双侧肾脏,于0.9%氯化钠溶液中清洗2遍,置于滤纸上吸干多余水分,对左侧肾脏称质量,从左侧肾脏纵切部分组织用于做HE、Masson染色;部分组织置液氮速冻后于-80 ℃冰箱保存备用;所取腹主动脉血样以3000 r·min-1离心10 min(r=17.5 cm),吸取上层血清置液氮速冻后于-80 ℃冰箱保存备用。

1.6 大鼠肾脏组织病理切片HE和Masson染色

肾脏样本用4%多聚甲醛固定,脱水后石蜡包埋,切片用二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水,经HE、Masson染色后在光学显微镜下观察肾脏病理变化和肾脏组织胶原沉积情况。

1.7 测定各项生理生化和肾功指标

1.7.1 记录大鼠24 h尿量计算肾脏系数 收集、记录各组大鼠24 h尿量;处死大鼠后摘取大鼠肾脏,称定左侧肾脏组织质量,计算肾脏系数(肾脏系数=梗阻侧单侧肾脏质量/体质量×100%)。

1.7.2 检测大鼠血清肌酐(serum creatinine,SCr)、血尿素氮(BUN)、白蛋白(ALB)含量 取眼眶血清,按试剂盒说明书测定血清中 Scr、BUN、ALB 含量。

1.7.3 检测大鼠SOD活力、MDA和HYP含量 称取 左侧肾脏组织 50~60 mg,制备肾组织匀浆液,按试剂盒说明书测定肾组织中MDA、HYP含量和SOD活力;取大鼠腹主动脉血清,按试剂盒说明书测定血清中SOD活力和MDA含量。

1.8 测定大鼠肾组织中生长转化因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)/Smad信号通路相关基因表达

取假手术组、模型对照组、贝那普利组和苦杏仁苷小剂量组大鼠左侧肾组织80 mg,经Trizol裂解后微量分光光度计测定RNA浓度,在将其逆转录成 cDNA。PCR反应体系(50 μL)包含2×Real SYBR Mixture 25 μL,10 μmol·L-1上、下游引物各1 μL,cDNA模板2 μL,双蒸水加至50 μL。聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)条件:95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 40 s,72 ℃ 20 s,72 ℃ 2 min,共40个循环。引物序列见表1,扩增以RAT Actin 基因表达作为内参照,采用2-ΔΔCt法计算TGF-β1、Smad3和Smad7 mRNA 的表达水平。

表1 PCR引物序列
Tab.1 PCR primer sequences
基因名称 上游引物(5'-3') 下游引物(5'-3')
RAT Actin CCCATCTATGAGGGTTACGC TTTAATGTCACGCACGATTTC
TGF-β1 CGCAACAACGCAATCTATG ACCAAGGTAACGCCAGGA
Smad3 CCAGTGCTACCTCCAGTGTT CTGGTGGTCGCTAGTTTCTC
Smad7 GGCTTTCAGATTCCCAACTTC CGCCATCCACTTCCCTTGT

表1 PCR引物序列

Tab.1 PCR primer sequences

1.9 统计学方法

采用SPSS17.0版软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差($\bar{x}\pm s$)表示,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间两两比较采用LSD检验。以 P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 大鼠肾组织的形态学变化

HE染色结果见图1,与假手术组大鼠比较,模型对照组大鼠肾间质损伤严重,可见大量炎症细胞浸润并伴有灶状纤维化组织增生,肾小管发生病变扩张,肾小管上皮细胞呈扁平脱落、坏死。与模型对照组比较,贝那普利组肾间质炎症细胞明显减少,未见明显纤维化组织增生,肾小管病变及上皮细胞脱落现象明显减轻;苦杏仁苷小剂量组肾间质病变较轻,可见少量炎症细胞浸润,未见明显纤维化组织增生,肾小管管腔萎缩情况及上皮细胞脱落现象明显减轻;苦杏仁苷中剂量组部分肾间质病变较轻,炎症细胞浸润及纤维化组织增生情况较轻,肾小管结构较清晰;苦杏仁苷大剂量组肾间质损伤较严重,可见大量炎症细胞浸润和纤维化组织,肾小管管腔萎缩、上皮细胞脱落现象较严重。Msaaon染色结果见图1,纤维化组织被染成蓝色,与假手术组比较,模型对照组肾间质损伤严重,可见大量胶原纤维沉积,肾小球萎缩至消失。与模型对照组比较,贝那普利组及苦杏仁苷小、中剂量组纤维化程度改善明显,肾间质可见少量胶原纤维化沉积;苦杏仁大剂量组纤维化程度改善不明显。半定量分析结果见图1,与假手术组比较,模型对照组纤维化程度明显升高(P<0.01);与模型对照组比较,贝那普利组及苦杏仁苷小、中、大剂量组纤维化程度明显降低(P<0.01),其中苦杏仁苷组以小剂量组效果最明显。


图1 6组大鼠肾组织HE、Masson染色及病理评分结果(n=10)
A.假手术组;B.模型对照组;C.贝那普利组;D.苦杏仁苷小剂量组;E.苦杏仁苷中剂量组;F.苦杏仁苷大剂量组。①与假手术组比较,t=-11.489~-1.702,P<0.01;②与模型对照组比较,t=2.128~11.489,P<0.01。

Fig.1 HE,Masson staining and pathological score of kidney tissues in six groups of rats(n=10)
A.sham group;B.model control group;C.benazepril group;D.amygdalin low dose group ;E.amygdalin medium dose group;F.amygdalin high dose group.①Cmopared with sham group,t=-11.489—-1.702,P<0.01;②Cmopared with model control group,t=2.128—11.489,P<0.01.

2.2 大鼠24 h尿量变化、脏器系数变化

结果见图2,与假手术组比较,模型对照组大鼠尿量显著减少(P<0.01),大鼠肾脏脏器系数显著升高(P<0.01),说明肾纤维化模型较稳定。与模型对照组比较,贝那普利组及苦杏仁苷小、中、大剂量组尿量显著增加(P<0.01),其中苦杏仁苷组以小剂量组尿量增加最明显;贝那普利组及苦杏仁苷小、中、大剂量组肾脏脏器系数显著降低(P<0.01),其中苦杏仁苷组以小剂量组肾脏系数降低最明显。


图2 6组大鼠尿量和肾脏系数比较(n=10)
A.假手术组;B.模型对照组;C.贝那普利组;D.苦杏仁苷小剂量组;E.苦杏仁苷中剂量组;F.苦杏仁苷大剂量组。①与假手术组比较,t=-8.724~ 6.579, P<0.01;②与模型对照组比较,t=-9.133~8.724,P<0.01。

Fig.2 Comparison of urine output and kidney coefficient among six groups of rats(n=10)
A.sham group;B.model control group;C.benazepril group;D.amygdalin low dose group ;E.amygdalin medium dose group;F.amygdalin high dose group.①Compared with sham group,t=-8.724—6.579,P< 0.01;②Compared with model control group,t=-9.133—8.724,P< 0.01.

2.3 大鼠血清BUN、Scr、ALB含量变化

结果见图3,与假手术组比较,模型对照组大鼠血清中BUN、Scr、ALB水平均显著升高(P<0.01),说明单侧输尿管梗阻导致大鼠肾脏功能受损。与模型对照组比较,贝那普利组BUN、Scr、ALB水平显著降低(P<0.01);苦杏仁苷小剂量组BUN水平显著降低(P<0.01),苦杏仁苷中、大剂量组BUN水平降低程度差异无统计学意义;苦杏仁苷小、中、大剂量组Scr、ALB水平显著降低(P<0.01),其中Scr、ALB降低水平以小剂量组效果最显著。


图3 6组大鼠血清BUN、Scr和ALB含量比较(n=10)
A.假手术组;B.模型对照组;C.贝那普利组;D.苦杏仁苷小剂量组;E.苦杏仁苷中剂量组;F.苦杏仁苷大剂量组。①与假手术组比较,t=-15.654~-4.434,P<0.01;②与模型对照组比较,t=1.592~ 15.654,P<0.01

Fig.3 Comparison of serum BUN,Scr and ALB levels among six groups of rats(n=10)
A.sham group;B.model control group;C.benazepril group;D.amygdalin low dose group ;E.amygdalin medium dose group;F.amygdalin high dose group.①Compared with sham group,t=-15.654—-4.434,P< 0.01;②Compared with model control group,t=1.592—15.654,P< 0.01.

2.4 大鼠SOD活力、MDA和HYP含量变化

结果见图4,与假手术组比较,模型对照组大鼠血清SOD活力显著降低,血清MDA含量显著升高(P<0.01)。与模型对照组比较,贝那普利组大鼠血清SOD活力显著升高,血清MDA含量显著降低(P<0.01);苦杏仁苷小剂量组大鼠血清SOD活力显著升高(P<0.01),苦杏仁苷中、大剂量组血清SOD活力升高程度差异无统计学意义;苦杏仁苷小、中、大剂量组血清MDA含量显著降低(P<0.01),其中血清MDA含量降低程度以小剂量组效果最显著。与假手术组比较,模型对照组大鼠肾组织SOD活力显著降低,组织MDA和HYP含量显著升高(P<0.01)。与模型对照组比较,贝那普利组大鼠肾组织SOD活力显著升高,组织MDA、HYP含量显著降低(P<0.01);苦杏仁苷中剂量组大鼠肾组织SOD活力显著升高(P<0.01),苦杏仁苷小、大剂量组大鼠肾组织SOD活力升高程度差异无统计学意义;苦杏仁苷小、中、大剂量组大鼠肾组织MDA含量显著降低(P<0.01),其中MDA含量降低程度以小剂量组效果最显著;苦杏仁苷小、中剂量组大鼠肾组织HYP含量显著降低(P<0.01),其中HYP含量降低程度以小剂量组效果最显著,大剂量组HYP含量降低程度差异无统计学意义。


图4 6组大鼠SOD活力、MDA和HYP含量比较(n=10)
A.假手术组;B.模型对照组;C.贝那普利组;D.苦杏仁苷小剂量组;E.苦杏仁苷中剂量组;F.苦杏仁苷大剂量组。①与假手术组比较, t=-14.659~6.223, P<0.01;②与模型对照组比较,t=-6.223~10.481,P<0.01。

Fig.4 Comparison of SOD activity,MDA and HYP contents among six groups of rats(n=10)
A.sham group;B.model control group;C.benazepril group;D.amygdalin low dose group ;E.amygdalin medium dose group;F.amygdalin high dose group.①Compared with sham group,t=-14.659—6.223,P<0.01;②Compared with model control group,t=-6.223—10.481,P<0.01.

2.5 大鼠肾组织中TGF-β1/Smad信号通路相关基因表达水平变化

结果见图5,与假手术组比较,模型对照组大鼠肾组织TGF-β1、Smad3 mRNA表达量显著升高,Smad7 mRNA表达量显著降低(P<0.01)。与模型对照组比较,贝那普利组、苦杏仁苷小剂量组大鼠组织TGF-β1、Smad3 mRNA表达量显著降低(P<0.01),Smad7 mRNA表达量显著升高(P<0.01),其中贝那普利组效果略优于苦杏仁苷小剂量组。


图5 4组大鼠肾组织中TGF-β1、Smad3 和Smad7 mRNA表达量比较(n=10)
A.假手术组;B.模型对照组;C.贝那普利组;D.苦杏仁苷小剂量组。①与假手术组比较,t=-19.853~6.325,P<0.01;②与模型对照组比较,t=-6.325~19.853,P<0.01。

Fig.5 Comparison of TGF-β1,Smad3 and Smad7 mRNA levels in renal tissues among four groups of rats(n=10)
A.sham group;B.model control group;C.benazepril group;D.amygdalin low dose group.①Compared with sham group,t=-19.853—6.325,P< 0.01;②Compared with model control group,t=-6.325—19.853,P< 0.01.

3 讨论

肾纤维化是各种肾脏疾病进展至终末期肾脏病的共同途径[24],发病机制复杂多样,一旦形成难以治愈,是一种危害极大的慢性疾病。本实验采用单侧输尿管梗阻方法制备大鼠肾纤维化模型,此方法被广泛应用于研究纤维化性肾病模型,具有成熟稳定、重现性好等特点[25]。肾功能是临床上监测肾纤维化的重要指标[26],Scr、BUN、ALB是临床监测肾功能的经典指标,三者表达水平在一定程度上反映肾损伤情况。SOD是机体内重要的抗脂质过氧化酶,在肾纤维化疾病进展过程中,抗氧化酶活力下降与梗阻侧肾纤维化的发生发展密切相关[27];MDA含量反映机体脂质过氧化程度[28]。HYP为胶原蛋白的特征性成分之一,可反映组织纤维化的程度[29],通过对肾组织中HYP含量测定可以了解其胶原蛋白分解代谢的情况。在本实验中,大鼠随梗阻时间的延长,与假手术组比较,模型对照组大鼠血清和组织SOD活力均下降,血清和组织MDA含量、HYP含量均上升,同时肾功能出现不同程度降低。HE和Masson染色结果显示肾间质、肾小管等结构损伤、肾组织胶原纤维化沉积,提示大鼠肾纤维化模型造模成功。苦杏仁苷是一种含氰基的糖苷类化合物,广泛存在于苦杏仁、桃仁、郁李仁等蔷薇科植物中,具有抗炎、免疫抑制、免疫调节等多种药理作用,并在抗肾、肺、肝、胰等器官纤维化方面显示出良好效果[30,31,32]。研究表明,苦杏仁苷对腺嘌呤诱导的慢性肾衰竭大鼠具有一定的保护作用,可改善肾功能,增加机体抗氧化和抗纤维化能力[33],还能够抑制肾成纤维化细胞的增殖和Ⅰ型胶原的合成、分泌,显著减轻肾脏的单侧输尿管结扎病理损伤程度,并延缓肾间质纤维化的进程[34]。

TGF-β1是肾纤维化发展的关键驱动因素之一[35],是一种有效的纤维化调节剂,促进细胞外基质成分的分泌,如胶原、弹性蛋白、原纤维蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白[36]。TGF-β1/Smad通路失调是肾纤维化的重要致病机制[37],TGF-β1可促进Smad3表达,抑制Smad7的表达,从而促进肾纤维化的发生、发展[38]。为进一步探究苦杏仁苷干预肾纤维化大鼠的作用机制,结合病理组织、生理生化、肾功能检测结果,选取效果显著的苦杏仁苷小剂量组大鼠肾组织,观察组织样品中TGF-β1、Smad3、Smad7的mRNA表达水平。研究发现,苦杏仁苷可通过抑制TGF-β1/Smad通路抑制细胞外基质的积累和转化,从而减轻糖尿病肾病大鼠模型肾组织的纤维化[39]。在本实验中,模型对照组大鼠肾组织TGF-β1、Smad3 mRNA表达量显著升高,Smad7 mRNA表达量显著降低,说明肾组织中TGF-β1/Smad通路被激活,促进肾纤维化疾病的发生发展。

综上所述,本实验采用成熟的单侧输尿管梗阻方法成功建立肾纤维化大鼠模型,结果表明,与模型对照组比较,苦杏仁苷组可显著改善肾间质及肾小管损伤情况,显著提高尿量,显著降低肾脏脏器系数及纤维化程度,降低Scr、BUN、ALB水平,升高血清和组织SOD活力,显著降低血清和组织MDA含量,降低组织HYP含量,其中以小剂量组效果最显著。同时苦杏仁苷还能显著下调TGF-β1、Smad3 mRNA的表达,上调Smad7 mRNA的表达,说明苦杏仁苷对肾纤维化大鼠肾脏具有良好的保护作用,能提高机体抗氧化能力,以小剂量作用效果,其作用机制可能是干预TGF-β1/Smad信号。本研究结果筛选出蒙古扁桃药材苦杏仁苷抗肾纤维化的有效剂量,为后续深入研究其最佳剂量及从代谢组学、转录组学、蛋白组学等多组学联合分析从整体水平阐述蒙古扁桃苦杏仁苷抗肾纤维化作用的机制奠定了基础,以期发现诊断、治疗肾纤维化疾病的敏感生物标志物,同时也为挖掘治疗肾纤维化药物提供了实验基础和依据。

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作者
李想
刘庆
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