目的 探讨蒙古扁桃苦杏仁苷对肾纤维化大鼠的作用及其机制。
方法 SD雄性大鼠 60只,按体质量随机分为6组:假手术组、模型对照组、贝那普利组和苦杏仁苷小、中、大剂量组,每组10只。除假手术组外其余各组大鼠均采用左侧输尿管梗阻方法造模。连续灌胃给药21 d后处死,记录大鼠24 h尿量、计算大鼠肾脏脏器系数;测定大鼠血清中尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、白蛋白(ALB)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量及组织中 SOD、MDA、羟脯胺酸(HYP) 含量;荧光定量聚合酶链反应(PCR) 法检测组织内转化生成因子 β1(TGF-β1)、Smad3、Smad7 mRNA的表达;采用苏木精-伊红(HE)和马松(Masson)染色观察左侧肾脏组织病理变化。
结果 与假手术组比较,模型对照组大鼠尿量显著减少(
Objective To investigate the effect and its possible mechanism of amygdalin(AMY) on renal fibrosis rats.
Methods A total of 60 male SD rats were randomly divided into sham operated group(SDG),model control group(MOD),benazepril hydrochloride tablets group(BHT),and amygdalin low-,medium-,high-dose groups(AMY-L,AMY-M,AMY-H).Renal fibrosis model was prepared by unilateral ureteral obstruction.After 21 days of continuous intragastric administration,the rats were sacrificed,the 24 h urine output was recorded,and the renal viscera coefficients were calculated;Blood urea nitrogen(BUN),serum creatinine(Scr),albumin(ALB),superoxide dismutase(SOD),malondialdehyde(MDA) in serum and the content of SOD,MDA,and hydroxyproline(HYP) in the tissue were detected.Quantitative polymerase chain reaction(qPCR) method was used to detect transforming growth factor β1(TGF-β1),Smad3,Smad7 mRNA expression level in the kidney.The hematoxylin-eosin(HE) and Masson staining was used to observe the histopathological changes in the kidney tissue.
Results Compared with the SDG,the urine output was significantly reduced(
开放科学(资源服务)标识码(OSID)
蒙古扁桃(
无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠 60只,体质量(190±20) g,购自北京大学医学部(实验动物科学部),生产许可证号:SCXK(京)2011-0012;饲养环境温度22~27 ℃,相对湿度(50±5)%。
苦杏仁苷(上海纯优生物科技有限公司,批号:719B052,含量≥98%);盐酸贝那普利(北京诺华制药有限公司,批号:X2633,规格:每片10 mg);戊巴比妥钠(德国默克公司);注射用青霉素钠(华北制药股份有限公司,批号:F7116323);羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)试剂盒(批号:20180429)、SOD试剂盒(批号:20180503)、MDA试剂盒(批号:20180504),均购自南京建成生物研究所;苏木精-伊红(HE)试剂盒、马松(Masson)试剂盒(南京建成科技有限公司);mRNA提取试剂TRIzol(TIANGEN,批号:U8926)、逆转录试剂盒 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific公司,批号:00920948);实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,q-PCR) 试剂 RealSYBR Mixture(康为世纪公司,批号:30537);PCR引物(宁夏科诺嘉华生物工程有限公司)。
RE-52型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);DZW-型水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂);TDZ4-WS低速自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司);CX31显微镜(日本奥林巴斯公司);MS-700研磨机(宁波美善美心电器有限公司);1510酶标仪(美国Thermo公司);Vlultifuge X1R低温高速离心机、NanoDrop 2000微量分光光度计(美国Thermo公司);温度梯度PCR仪、7500型qPCR仪(美国Applied Biosysterms)。
SPF级SD雄性大鼠60只,按体质量随机分为假手术组,肾纤维化模型对照组,贝那普利组,苦杏仁苷小、中、大剂量组,每组10只。采用单侧输尿管梗阻方法制备肾纤维化大鼠模型[23],大鼠自购回适应性饲养1周后,称质量,麻醉,将麻醉大鼠仰卧位固定于鼠板上,手术区域脱毛备皮并用聚维酮碘消毒,沿大鼠左肋骨边缘下方1.5 cm处向外横切口2 cm,剪开外皮后分离腹膜,暴露左肾,分离出左侧输尿管后用手术缝合线进行结扎,结扎后再将肾脏回纳,逐层缝合大鼠皮毛组织,并消毒。假手术组大鼠进行同样手术,不结扎。造模第2天给药,模型对照组、假手术组灌注0.9%氯化钠溶液4 mL·kg-1,贝那普利组按1.5 mg·kg-1灌注盐酸贝那普利,苦杏仁苷小、中、大剂量组分别按20,40,80 mL·kg-1[22]灌胃给药,每天给药1次,连续给药21 d,给药期间大鼠自由进食进水。
末次给药后眼眶静脉丛采血,血样以3500 r·min-1离心10 min(
肾脏样本用4%多聚甲醛固定,脱水后石蜡包埋,切片用二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水,经HE、Masson染色后在光学显微镜下观察肾脏病理变化和肾脏组织胶原沉积情况。
1.7.1 记录大鼠24 h尿量计算肾脏系数 收集、记录各组大鼠24 h尿量;处死大鼠后摘取大鼠肾脏,称定左侧肾脏组织质量,计算肾脏系数(肾脏系数=梗阻侧单侧肾脏质量/体质量×100%)。
1.7.2 检测大鼠血清肌酐(serum creatinine,SCr)、血尿素氮(BUN)、白蛋白(ALB)含量 取眼眶血清,按试剂盒说明书测定血清中 Scr、BUN、ALB 含量。
1.7.3 检测大鼠SOD活力、MDA和HYP含量 称取 左侧肾脏组织 50~60 mg,制备肾组织匀浆液,按试剂盒说明书测定肾组织中MDA、HYP含量和SOD活力;取大鼠腹主动脉血清,按试剂盒说明书测定血清中SOD活力和MDA含量。
取假手术组、模型对照组、贝那普利组和苦杏仁苷小剂量组大鼠左侧肾组织80 mg,经Trizol裂解后微量分光光度计测定RNA浓度,在将其逆转录成 cDNA。PCR反应体系(50 μL)包含2×Real SYBR Mixture 25 μL,10 μmol·L-1上、下游引物各1 μL,cDNA模板2 μL,双蒸水加至50 μL。聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)条件:95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 40 s,72 ℃ 20 s,72 ℃ 2 min,共40个循环。引物序列见
采用SPSS17.0版软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差($\bar{x}\pm s$)表示,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间两两比较采用LSD检验。以
HE染色结果见
结果见
结果见
结果见
肾纤维化是各种肾脏疾病进展至终末期肾脏病的共同途径[24],发病机制复杂多样,一旦形成难以治愈,是一种危害极大的慢性疾病。本实验采用单侧输尿管梗阻方法制备大鼠肾纤维化模型,此方法被广泛应用于研究纤维化性肾病模型,具有成熟稳定、重现性好等特点[25]。肾功能是临床上监测肾纤维化的重要指标[26],Scr、BUN、ALB是临床监测肾功能的经典指标,三者表达水平在一定程度上反映肾损伤情况。SOD是机体内重要的抗脂质过氧化酶,在肾纤维化疾病进展过程中,抗氧化酶活力下降与梗阻侧肾纤维化的发生发展密切相关[27];MDA含量反映机体脂质过氧化程度[28]。HYP为胶原蛋白的特征性成分之一,可反映组织纤维化的程度[29],通过对肾组织中HYP含量测定可以了解其胶原蛋白分解代谢的情况。在本实验中,大鼠随梗阻时间的延长,与假手术组比较,模型对照组大鼠血清和组织SOD活力均下降,血清和组织MDA含量、HYP含量均上升,同时肾功能出现不同程度降低。HE和Masson染色结果显示肾间质、肾小管等结构损伤、肾组织胶原纤维化沉积,提示大鼠肾纤维化模型造模成功。苦杏仁苷是一种含氰基的糖苷类化合物,广泛存在于苦杏仁、桃仁、郁李仁等蔷薇科植物中,具有抗炎、免疫抑制、免疫调节等多种药理作用,并在抗肾、肺、肝、胰等器官纤维化方面显示出良好效果[30,31,32]。研究表明,苦杏仁苷对腺嘌呤诱导的慢性肾衰竭大鼠具有一定的保护作用,可改善肾功能,增加机体抗氧化和抗纤维化能力[33],还能够抑制肾成纤维化细胞的增殖和Ⅰ型胶原的合成、分泌,显著减轻肾脏的单侧输尿管结扎病理损伤程度,并延缓肾间质纤维化的进程[34]。
TGF-β1是肾纤维化发展的关键驱动因素之一[35],是一种有效的纤维化调节剂,促进细胞外基质成分的分泌,如胶原、弹性蛋白、原纤维蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白[36]。TGF-β1/Smad通路失调是肾纤维化的重要致病机制[37],TGF-β1可促进Smad3表达,抑制Smad7的表达,从而促进肾纤维化的发生、发展[38]。为进一步探究苦杏仁苷干预肾纤维化大鼠的作用机制,结合病理组织、生理生化、肾功能检测结果,选取效果显著的苦杏仁苷小剂量组大鼠肾组织,观察组织样品中TGF-β1、Smad3、Smad7的mRNA表达水平。研究发现,苦杏仁苷可通过抑制TGF-β1/Smad通路抑制细胞外基质的积累和转化,从而减轻糖尿病肾病大鼠模型肾组织的纤维化[39]。在本实验中,模型对照组大鼠肾组织TGF-β1、Smad3 mRNA表达量显著升高,Smad7 mRNA表达量显著降低,说明肾组织中TGF-β1/Smad通路被激活,促进肾纤维化疾病的发生发展。
综上所述,本实验采用成熟的单侧输尿管梗阻方法成功建立肾纤维化大鼠模型,结果表明,与模型对照组比较,苦杏仁苷组可显著改善肾间质及肾小管损伤情况,显著提高尿量,显著降低肾脏脏器系数及纤维化程度,降低Scr、BUN、ALB水平,升高血清和组织SOD活力,显著降低血清和组织MDA含量,降低组织HYP含量,其中以小剂量组效果最显著。同时苦杏仁苷还能显著下调TGF-β1、Smad3 mRNA的表达,上调Smad7 mRNA的表达,说明苦杏仁苷对肾纤维化大鼠肾脏具有良好的保护作用,能提高机体抗氧化能力,以小剂量作用效果,其作用机制可能是干预TGF-β1/Smad信号。本研究结果筛选出蒙古扁桃药材苦杏仁苷抗肾纤维化的有效剂量,为后续深入研究其最佳剂量及从代谢组学、转录组学、蛋白组学等多组学联合分析从整体水平阐述蒙古扁桃苦杏仁苷抗肾纤维化作用的机制奠定了基础,以期发现诊断、治疗肾纤维化疾病的敏感生物标志物,同时也为挖掘治疗肾纤维化药物提供了实验基础和依据。