目的 探讨岭南中药救必应对吲哚美辛所致大鼠小肠黏膜损伤的防治作用及其机制。
方法 将SD雄性大鼠随机分为正常对照组(6只)、模型对照组(10只)和救必应小、大剂量组(8,16 g·kg-1,各10只);造模前,正常对照组和模型对照组灌胃纯水,受试药组灌胃小、大剂量救必应,1 h后,模型对照组和受试药组每只大鼠皮下注射吲哚美辛5 mg·kg-1,正常对照组皮下注射等体积0.9%氯化钠溶液,造模注射及灌胃给药均为每天1次,共4 d;末次给药后禁食不禁水24 h,第5天处死动物,计算各组大鼠小肠黏膜损伤大体评分,组织切片苏木精-伊红(HE)染色,计算小肠黏膜损伤病理评分;Amplite荧光法检测血浆
Objective To explore the protective effect and mechanisms of
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岭南中药救必应为冬青科植物铁冬青(
1.1.1 药物和动物 救必应为冬青科植物铁冬青
SD大鼠,雄性,无特定病原体(SPF)级,体质量180~220 g,购自广州中医药大学动物实验中心,实验动物生产合格证:SCXK(粤)2018-0034;实验环境:SPF级;实验动物使用许可证:SYXK(粤)2018-0001。大鼠饲养条件:12 h明暗交替、温度为18~26 ℃,日温差≤3 ℃,相对湿度40%~70%,适应性喂养7 d后开始实验。10%水合氯醛麻醉后取样及处死。
1.1.2 试剂和主要仪器 吲哚美辛(美国Sigma公司,批号:056M4036V);通用链霉卵白素-生物素法免疫组化试剂盒(SP-9000)、二氨基联苯胺(diamino-benzidine,DAB)试剂盒(北京中杉金桥有限公司); ZO-1抗体(61-7300),Occludin抗体(40-4700)(美国Thermo Fisher Scientific公司);二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法蛋白定量试剂盒(凯基生物公司);
ME204型电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司,感量:0.1 mg),ClarityTM western ECL substrate、ChemiDocTMXRS+成像仪、TM电泳仪、垂直电泳仪槽(美国BIO-RAD公司);DNA Expert型多用途微量板检测仪(奥地利TECAN公司);HeraousMultifuge X1R离心机(美国 Thermo Fisher公司)。
1.2.1 救必应水提物的制备 称取救必应药材600 g,掰成小块,12倍体积量纯水浸泡2 h,180 ℃煮开,后用120 ℃煮2 h,纱布过滤;滤渣用12倍体积纯水煎煮2 h,纱布过滤,合并2次滤液;滤液浓缩至1 g·mL-1(约600 mL),-60 ℃过夜,次日真空干燥2 d,得救必应水提物冻干粉105 g(得率为17.5%),-20 ℃保存。
1.2.2 动物分组、造模和给药方法 按Excel软件产生的随机数字表将大鼠分成正常对照组6只,模型对照组及救必应小、大剂量(8,16 g·kg-1)组各10只;大鼠适应性喂养1周,体质量(260±10) g;造模前受试药组灌胃救必应水提物(8,16 g·kg-1),模型对照组和正常对照组灌胃等体积纯水;1 h后,模型对照组和受试药组分别皮下注射吲哚美辛5 mg·kg-1造模,正常对照组皮下注射等体积0.9%氯化钠溶液。按10 mL·kg-1体积灌胃和皮下注射均为每天1次,共4 d;末次灌胃后禁食不禁水24 h,第5天以10%水合氯醛20 mL·kg-1腹腔注射麻醉大鼠,剖腹,腹主静脉采血,并取小肠组织剪开;肉眼观察小肠黏膜损伤情况,按评分细则计算损伤的大体评分;取损伤最明显的小肠组织(长约2 cm)置4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋切片,苏木精-伊红(HE)染色,显微镜下进行小肠组织病理评分;其余小肠冰上刮取黏膜组织,-80 ℃冰箱保存,以备后续免疫印迹(Western blotting)实验。
1.2.3 小肠黏膜损伤大体及病理评分标准 小肠黏膜损伤大体评分[5]:按溃疡和粘连分别评分,总分为二者之和。溃疡评分:游标卡尺测量全小肠的溃疡长度,每一毫米计1分,宽度>1 mm计分加倍,累积评分。粘连评分:无粘连为0分;粘连较轻,少许力量即可将小肠与其他组织分开为1分;粘连较重为2分。
小肠黏膜损伤病理评分[6],显微镜下观察小肠组织病理变化。0分:肠黏膜绒毛正常;1分:绒毛顶端上皮下出现囊状间隙,并伴有毛细血管充血;2分:上皮下间隙扩大,中度固有层水肿,中央乳糜管扩张;3分:固有层明显水肿,肠黏膜上皮层细胞变性、坏死,少数绒毛顶端脱落;4分:上皮细胞层变性坏死、脱落,部分绒毛脱落、固有层裸露,毛细血管扩张、充血;5分:绒毛脱落,固有层崩解,出血或溃疡形成。
1.2.4 免疫组化法检测小肠组织蛋白表达 组织切片60 ℃加热1 h,常规脱蜡、水化;放进0.01 mol·L-1柠檬酸盐缓冲液(pH值6.0),微波炉加热修复抗原,先中高火9 min,自然冷却15 min,再高火5 min,自然冷却1 h;SP法阻断内源性过氧化物酶10 min,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次,每次5 min;正常山羊血清封闭液封闭15 min;孵育一抗(ZO-11:200,Occludin 1:100,Claudin-1 1:100,E-cadherin 1:100,α-catenin 1:100,β-catenin 1:100,CDX-2 1:100),4 ℃过夜,37 ℃复温45 min,甩去一抗,冲洗,滴加二抗,室温孵育15 min,冲洗,滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,室温孵育15 min,冲洗,擦干,DAB室温显色10 min,显微镜下控制染色程度(细胞质呈棕色则判为阳性表达细胞);自来水冲洗5 min终止反应;苏木精复染,自来水冲洗2 min;常规脱水,中性树胶封片、镜检。正常对照组、模型对照组、救必应水提物16和8 g·kg-1组全部样本均进行免疫组化检测,若显色失败、染色效果较差时,则视作脱落样本不纳入统计。
组织切片镜检方法及图片数据化:显微镜下所见棕黄色颗粒即为所测蛋白阳性表达,每张切片随机选取5个视野(×200)进行评分,该5个视野再选取重点部位显微镜下(×400)观察该蛋白表达。ImageJ软件及IHC-Profiler插件处理图片,软件自动分离棕黄色部分(目标蛋白)进行测量,并得出“Negative,Low positive,Positive,and High positive”[7]。将软件所得结果量化,Negative为0分,Low positive为1分,Positive为2分,High positive为3分,计算每张切片5个视野的平均阳性得分,即为该蛋白表达的半定量结果。
1.2.5 Western blotting法检测小肠黏膜蛋白表达 总蛋白提取及蛋白样品准备,匀浆:小肠黏膜组织每50 mg加裂解液1 mL,低温快速电动匀浆。12000×
蛋白质免疫印迹,制胶:按照伯乐快速制胶试剂盒说明书配制。电泳:所有蛋白样品调至等浓度后上样,先用恒压80 V,当跑至分离胶后改为200 V。转膜:恒流250 mA电转1.5~2 h。封闭:取膜,TBST洗5 min,3次,用5%脱脂奶粉封闭1.5 h。孵育一抗:TBST洗膜,切膜,并放于对应的稀释后的一抗4 ℃过夜(ZO-1 1:500,Occludin 1:500,Claudin-1 1:500,E-cadherin 1:1000,α-catenin 1:1000,β-catenin 1:1000,CDX-2 1:500)。室温复温20 min。孵育二抗:TBST洗膜,放入对应的稀释好的二抗1 h(鼠二抗及兔二抗1:5000)。显影:TBST洗膜,显影液浸泡30 s后显影。图像处理:用ImageJ软件处理得到所对应的吸光度(
1.2.6 Amplite荧光法测血浆
1.2.7 统计学方法 采用SPSS25.0版统计软件分析,计量资料分析进行正态性及方差齐性检验。正态性计量资料用均数±标准差($\bar{x}\pm s$)表示,多组均值比较用单因素方差分析,方差齐用Dunnett's或者SNK法;若方差不齐用Dunnett's T3法;以
实验结束时模型对照组和救必应小剂量组动物死亡各2只(2/10),救必应大剂量组死亡4只(4/10),动物死亡原因均为造模所致小肠穿孔,4组死亡数差异无统计学意义。
对各组存活大鼠进行小肠黏膜损伤大体评分,结果见
由
免疫组化结果见
免疫组化和免疫印迹检测结果见
免疫组化和免疫印迹检测结果见
正常对照组、模型对照组和救必应小、大剂量组血浆
胃肠黏膜损伤是临床常见病变,其中非甾体抗炎药是导致胃肠黏膜损伤的常见因素。报道显示,在胶囊内窥镜检查者中76.3%服用非甾体抗炎药的受试者发现了小肠黏膜的糜烂或溃疡性病变[8]。救必应在岭南地区广泛用于治疗胃肠病变,但其作用机制特别是对小肠病变的干预作用研究较少,本研究在非甾体抗炎药吲哚美辛所致大鼠小肠黏膜损伤模型上,观察救必应防治肠黏膜损伤的作用及机制。
细胞间连接(紧密连接、粘附连接、缝隙连接和桥粒等)是维持肠黏膜屏障的关键因素,其中紧密连接和粘附连接对维护肠黏膜屏障的作用尤为突出。细胞间连接控制着细胞旁转运途径的通透性,从而调节肠道屏障通透性[9,10]。临床研究发现,炎症性肠病患者在活动期紧密连接功能下调,其超微结构和蛋白组成被改变,并引起肠道通透性增加[11]。本研究结果表明,救必应水提物对吲哚美辛所致大鼠小肠黏膜损伤有防治作用,作用机制与其提高造模大鼠小肠黏膜紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin和Claudin-1)和黏附连接蛋白(E-cadherin、α-catenin和β-catenin)表达有关;川陈皮素、广藿香提取物等有效组分能通过调节紧密蛋白的功能维持肠上皮屏障的完整性和通透性,从而减轻溃疡性结肠炎的症状[12],本研究结果与之有相似之处,提示细胞间连接蛋白是调理脾胃中药的作用靶点之一。
血浆
CDX-2为肠特异性转录因子,能调节Rho-GEFs转录从而激活Rho信号级联,导致肌动蛋白细胞骨架的重组和粘附连接的增强[15]。肠上皮特异性缺乏CDX-2的小鼠出现巨噬细胞浸润和促炎级联反应的激活,导致慢性炎症反应[16]。本研究结果表明,吲哚美辛诱导的大鼠小肠黏膜损伤模型黏膜CDX-2表达下降,而救必应能提高造模大鼠小肠黏膜CDX-2表达,且有研究报道黄芩素、黄芩苷等清热解毒中药成分通过激活CDX-2而间接激活孕烷X受体,减轻小鼠实验性溃疡性结肠炎[17],本实验结果与之有相似之处。
本研究表明,救必应可通过作用于小肠黏膜紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin和Claudin-1)和粘附连接蛋白(E-cadherin、α-catenin和β-catenin)、肠特异性转录因子CDX-2、肠通透性指标(血浆