防风(批号:190601)、炒白术(批号:201001)、鱼腥草(批号:200701)、赤芍(批号:191201)、柴胡(批号:191201)、桔梗(批号:200701)、浙贝母(批号:191201)、冬桑叶(批号:200101)、川桂枝(批号:200101)、炒白芍(批号:191201)、板蓝根(批号:190501)、生甘草(批号:201001)均购自安徽省亳州市坤源医药有限公司,药材经咸宁市中心医院主管中药师孟婷鉴定,均符合《中华人民共和国药典》2020年版一部规定。

糊精(安徽山河药用辅料股份有限公司,批号:200308)、甜菊糖(安徽山河药用辅料股份有限公司,批号:200308)、柴胡皂苷a(含量:94.80%,批号:110777-201912,购自中国食品药品检定研究院);乙腈(批号:202889)、甲醇(批号:203074)为色谱级,均购自美国Fisher chemical公司。

Thermo UltiMate3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技公司);DSH-50-1电子水分测定仪(上海奥平科学仪器制造有限公司);ZP-200振荡器(苏州培英实验设备有限公司);TDL-60B低速离心机(上海安亭科学仪器厂);GLTQ-50L多功能提取浓缩罐(上海格翎环境科技有限公司);101-2AB电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司);RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);YOKO-BD薄层电动点样仪(武汉药科新技术开发有限公司);ZY-600U薄层色谱自动成像分析系统(北京先驱威锋技术开发公司)。

处方组成为:防风、炒白术、鱼腥草、赤芍、柴胡、浙贝母、冬桑叶、川桂枝、炒白芍、板蓝根各10 g,桔梗5 g,生甘草6 g,总剂量111 g,水煎服(加水量为药材量的5.4倍),每日2剂,早晚各1次。

称取处方量各药材饮片,分别加入一定量水,置多功能提取器内,采用水回流提取法提取3次,得到含固率为29.3 %的干膏,粉碎,备用。将干浸膏、糊精、甜菊糖按照一定比例混合,制粒,干燥,整粒。本成品检验合格后制成单包装颗粒,每袋装量10 g,贴标签。

2.2.1 成型率的计算 将制备好的颗粒称质量,先过筛孔内径2.00 mm(一号)筛,再过筛孔内径0.18 mm(五号)筛,收集能通过筛孔内径2.00 mm筛,但不能通过筛孔内径0.18 mm的颗粒,称质量,计算成型率。

2.2.2 溶化率的测定 在干燥至恒质量的10 mL离心管中加入精密称量的颗粒,加入沸水5 mL,持续搅拌5 min,3000 r·min^-1离心15 min(离心半径r=13 cm),弃上清液,将残渣在80 ℃条件下干燥至恒质量,精密称定质量,计算溶化率。

2.2.3 休止角的测定 采用固定漏斗法,将漏斗固定于水平放置的坐标纸上高1.5 cm的位置(H),缓慢将颗粒沿漏斗壁倒入最上面的漏斗中,直到形成的颗粒圆锥尖端接触到漏斗口为止,测算圆锥底部的直径(2R),计算休止角tgα=H/R。成型性、溶化率、休止角的权重系数各设为45%,30%,25%,综合评分=45%×(成型率/最大成型率)+30%×(溶化率/最大溶化率)+25%×(最小休止角/休止角)^[4]。

2.2.4 堆密度的测定 取本品颗粒适量,沿壁缓慢加入干燥至恒质量的10 mL量筒中,待颗粒表面至10 mL刻度处,称质量,减去干燥空量筒质量即为颗粒的质量,平行测定3次,计算堆密度。堆密度ρ=颗粒质量/容积×100%。

2.2.5 吸湿性的测定 配制氯化钠饱和溶液,置于玻璃干燥器中,25 ℃恒温平衡48 h。精密称定本品颗粒2 g,平行3份,置于干燥至恒质量的称量瓶中,于24,48,72,96,120,144,168 h后称质量,计算吸湿百分率。吸湿率越低颗粒越不容易吸潮,质量也越稳定^[5,6]。吸湿百分率=(吸湿后颗粒质量-吸湿前颗粒质量)/吸湿前颗粒质量×100%。

2.2.6 水分测定 采用水分测定仪平行测定3次。

2.3.1 药物与辅料比例考察 称取干浸膏粉20.3 g 3份,分别称取糊精10.2 g(药辅比1:0.5)、14.2 g(药辅比1:0.7)、18.3 g(药辅比1:0.9),将干浸膏粉与糊精混合,过筛孔内径0.25 mm使其充分混匀;按一定比例混合,加入适宜的黏合剂制备软材,挤压过筛制粒,干燥30 min。整粒后遵循《中华人民共和国药典》2020年版对颗粒成型率、溶化率、休止角等指标进行综合评价,以此优选最佳药辅比。

根据复方肺毒清颗粒制备工艺,按处方称取各药材饮片30付,总质量为3330 g,置多功能提取器内,总共提取3次。第1次加10倍量水,煎煮2 h(水沸腾后计时),第2次加8倍量水,煎煮2 h,第3次加6倍量水,煎煮1 h。合并水煎液,滤液浓缩至相对密度约1.08(60~70 ℃)的稠膏4160 g,将稠膏烘干,得到干膏1218 g(含固率为29.3 %)。采用湿法制粒,筛选药辅比,综合评分显示最高的药辅比为1:0.9,但是为减少患者服用量,增加患者的顺应性,选择1:0.5比例作为最佳药辅比(表1)。取20份处方量的干浸膏做小试颗粒,得到水分为3.19%的肺毒清颗粒(每袋10 g)。

2.3.2 矫味剂选择 为寻找最佳比例,选用木糖醇作为矫味剂,进行以下实验:取3 g干膏粉6份,分别加入木糖醇0.10,0.20,0.30,0.40,0.50,0.60 g搅拌均匀。请6名实验员品尝口感,均认为口感较苦。另选择甜菊糖作为矫味剂,称取1.0:0.5药辅比颗粒1 g,加入甜菊糖0.01 g,相同6名实验员品尝口感,均认为口感稍甜,具香甜味,故选用1% 甜菊糖作为矫味剂。

2.3.3 小试工艺结果 本品颗粒剂粒度均匀,颗粒颜色由浅棕至深棕色,《中华人民共和国药典》2020年版规定,能通过筛孔内径2.00 mm但不能通过筛孔内径0.18 mm的颗粒及粉末所占百分比<15%符合标准,本品颗粒成型率为96.31%,符合《中华人民共和国药典》规定;休止角是考察药物的流动性,休止角越小,颗粒剂的流动性越好^[7],一般认为,α≤30 °时流动性好,α≤40 °时可以满足生产过程中对流动性的需求,本品颗粒的休止角为15.47 °,颗粒的流动性较好;颗粒剂的成型率、溶化率、休止角、堆密度具体结果见表2。

吸湿性检测7个时间点,每24 h检测1次,分别是24,48,72,96,120,144,168 h测定颗粒剂的吸湿性,计算吸湿百分率。实验结果表明,小试生产的复方肺毒清颗粒,吸湿拟合回归曲线方程为Y=-0.00 043X²+0.137 7X+1.995 7,R值为0.994 1,其拟合程度较好,平衡吸湿时间为137.7 h,平衡吸湿率为12.80%,见表3。

2.3.4 制剂成型工艺验证 采用湿法制粒,根据药辅比筛选,以干膏粉为原料,以糊精和甜菊糖为辅料,75%乙醇、纯化水适量作润湿剂,干膏粉:糊精:甜菊糖=1:0.50:0.01的药辅比进行制剂,上述原辅料均过筛孔内径0.25 mm(60目)后,在筛孔内径1.18 mm(14目)标准筛上挤压,制湿颗粒,干燥30 min,整粒后分单包装。按照颗粒剂相关检查项目对其进行粒度、水分、溶化率检查,结果显示:该小试颗粒的粒度均<15%,水分均<5%,颗粒均完全溶化,符合《中华人民共和国药典》2020年版颗粒剂相关检查要求。

2.4.1 供试品溶液的制备 精密称取本品颗粒2.0 g,研钵中研细,加入甲醇12 mL溶解,超声处理15 min,滤过,挥干后得滤渣,加入纯化水1.5 mL溶解滤渣,溶解后加入水饱和正丁醇溶液5 mL,置于分液漏斗中震荡萃取3次,将正丁醇合并,挥干正丁醇溶液得滤渣,滤渣加甲醇定容至1.5 mL,作为供试品溶液^[8]。

2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取柴胡皂苷a对照品0.1 mg,加入甲醇2 mL,制成浓度为0.05 mg·mL^-1对照品溶液。

2.4.3 阴性溶液、对照药材溶液的制备 取不含柴胡药材的阴性颗粒及柴胡药材,同“2.4.1”项方法制成阴性对照溶液和对照药材溶液。

2.4.4 鉴别 吸取供试品溶液及阴性对照溶液5 μL,对照药材溶液及对照品溶液10 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯:乙醇(95%):水=8:2:1的比例为展开剂进行展开,晾干,喷2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液显色剂,于105 ℃ 加热至斑点清晰,置紫外灯(波长365 nm)下检视^[9]。供试品与对照药材及柴胡皂苷a对照品相应的色谱位置上显示相同的黄色荧光斑点,而阴性对照无相应的斑点,见图1。

2.5.1 色谱条件 色谱柱:6 L sciences Inc ODS-3(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相A为乙腈,流动相B为水,梯度洗脱:0~40 min,85%→40%B;40~45 min,40%→85%B;柱温40 ℃;流速1 mL·min^-1;检测波长为210 nm,进样:20 μL,在此条件下,样品中柴胡皂苷a与其他成分色谱峰完全分离,和相邻色谱峰的分离度>1.5。

2.5.2 对照品溶液的制备 精密称取柴胡皂苷a 5.17 mg,加入甲醇5 mL溶解,配成柴胡皂苷a 1.034 mg·mL^-1的母液,密封,放入4 ℃冰箱,备用。

2.5.3 供试品溶液的制备 精密称取样品10.013 0 g,研钵中研细,置具塞锥形瓶中,加入含5%浓氨试液的甲醇溶液25 mL,密塞,超声(功率:200 W,频率:40 kHz)30 min,离心取上清液10 mL,挥干后加甲醇定容至5.0 mL即为供试品溶液。

2.5.4 阴性溶液的制备 精密称取缺柴胡的样品颗粒,同“2.5.3”项方法制成阴性对照品溶液。

2.6.1 专属性实验 在选定的色谱条件下,分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液各20 μL,注入高效液相色谱仪测定,结果柴胡皂苷a标准品与供试品中其他成分色谱峰完全分离,在与对照品色谱相应的保留时间上有相同的色谱峰,而阴性溶液无干扰,见图2。

2.6.2 线性关系实验 将母液浓度为1.034 mg·mL^-1柴胡皂苷a标准品,等比稀释得0.064 6,0.129 3,0.258 5,0.517 0,1.034 0 mg·mL^-15个浓度样品,每个连续进样2次,每次20 μL。以含量为横坐标,色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,柴胡皂苷a线性回归方程为Y=110.26X+0.935 7,R=1,在0.06~0.98 mg·mL^-1浓度范围内,含量与峰面积线性关系良好。

2.6.3 精密度实验 精密吸取柴胡皂苷a对照品溶液20 μL,连续进样6次,测定色谱峰面积,计算RSD值。结果显示柴胡皂苷a峰面积RSD为0.21%,表明仪器精密度良好。

2.6.4 稳定性实验 取复方肺毒清颗粒,按“2.5.3”项下制备供试品溶液,分别于0,2,4,8,12,24 h进样20 μL,记录峰面积,结果显示:柴胡皂苷a的 RSD为1.493%,表明溶液在24 h内稳定。

2.6.5 重复性实验 取复方肺毒清颗粒(批号:20201201)6份,按“2.5.3”项下分别制备供试品溶液,按上述色谱条件测定柴胡皂苷a的含量,每个样品进样2次,得到柴胡皂苷a的平均含量为0.192 mg·g^-1,RSD为0.679%。

2.6.6 回收率实验 取已知含量样品(批号:20201201)6份,精密称定每份2 g;各份样品中加入一定量的对照品溶液,按“2.5.3”项下分别制备供试品溶液,再按“2.5.1”项色谱条件进样测定含量,分别进样20 μL,记录峰面积并计算加样回收率,结果平均回收率为97.49%,RSD为1.34%,见表4。

取不同批次复方肺毒清颗粒(批号:20201201,20201202,20201203),按供试品制备方法制备样品溶液,进样量20 μL,按“2.5.1”项色谱条件进行柴胡皂苷a含量测定,记录峰面积,按照外标法计算含量。结果显示样品中(每袋10 g)柴胡皂苷a平均含量为0.192 mg·g^-1,最低浓度为0.191 mg·mL^-1,RSD为0.679%。