作者简介: 黄丽贞(1982-),女,广西南宁人,实验师,硕士,主要研究方向:中药药效筛选。电话:0771-3137585,E-mail:88011457@qq.com。
通信作者: 马雯芳(1983-),女,广西南宁人,讲师,博士,主要研究方向:中药品种、质量研究。电话:0771-3137585,E-mail:alswen@163.com。
目的 研究山桔叶水提物对小鼠的镇痛抗炎作用,并探讨其作用机制。方法 采用0.7%醋酸致小鼠扭体反应、热板仪致小鼠疼痛、二甲苯致小鼠耳廓肿胀、1%角叉菜胶致小鼠足肿胀及测定炎足中前列腺素E2(PGE2)含量、0.6%醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加、小鼠棉球肉芽肿方法,观察山桔叶水提物镇痛抗炎作用。结果 山桔叶水提物大、中、小剂量组醋酸致小鼠扭体反应次数减少( P<0.01或 P<0.05),提高热板致小鼠疼痛的痛阈值( P<0.01或 P<0.05);抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀度( P<0.01或 P<0.05)、1%角叉菜胶致小鼠炎足肿胀( P<0.01或 P<0.05)、1%角叉菜胶致小鼠炎足PGE2产生( P<0.01)、0.6%醋酸致小鼠腹腔通透性增加( P<0.05)及小鼠棉球肉芽肿产生( P<0.01或 P<0.05)。结论 山桔叶水提物对小鼠有镇痛抗炎作用。
Objective To observe the analgesic and anti-inflammatory effects of the water extract of Glycosmis citrifolia (Willd.) Lindl.on mice and explore the mechanism.Methods The analgesic and anti-inflammatory effects were evaluated by 0.7% acetic acid-induced writhing test,the hot plate test,tests of dimethylbenzene-induced ear swelling,1% carrageenan-induced paw edema,determination of PGE2 in inflammatory feet,0.6% acetic acid-induced increase in peritoneal capillary permeability and cotton ball granuloma.Results The water extract of Glycosmis citrifolia (Willd.) Lindl.at low,medium and high doses can reduce the acetic acid-induced writhing times ( P<0.01 or P<0.05),increase the pain threshold of mice ( P<0.01 or P<0.05),inhibit dimethylbenzene-induced ear swelling ( P<0.01 or P<0.05),1% carrageenan-induced paw edema ( P<0.01 or P<0.05) and PGE2 production ( P<0.01),0.6% acetic acid-induced increase of peritoneal capillary permeability ( P<0.05),and the development of cotton ball granuloma ( P<0.01 or P<0.05).Condusion The water extract of Glycosmis citrifolia (Willd.) Lindl.shows analgesic and anti-inflammatory effects on mice.
山桔叶为芸香科植物小花山小橘[ Glycosmis citrifolia(Willd.) Lindl.]的叶,在广西、广东有着悠久的药用历史,具有化痰止咳、消积、破瘀消肿的功效[1,2]。目前对山桔叶药理作用的报道笔者较少见到,笔者在本实验中采用镇痛和抗炎实验方法,观察山桔叶水提取物镇痛和抗炎作用,以期为探索其药理作用提供依据。
昆明种小鼠,体质量(20±2)g,清洁级,由广西中医药大学实验动物中心提供,合格证号:桂医动字第 11004号。实验前将动物在室内适应性饲养2 d,室温20~28 ℃,相对湿度60%~80%。
硫酸罗通定注射液(广东新峰药业股份有限公司,规格:60 mg/2 mL,批号:131003),醋酸地塞米松片(浙江仙琚制药有限公司,规格:每片75 mg,批号:140646);二甲苯(天津富宇精细化工有限公司,批号:130328);甲醇(成都市科龙化工试剂厂,批号:20130817);冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司,批号:T20090628);氯化钠注射液(贵州天地药业有限责任公司,批号:A12092110)。
山桔叶采自广西壮族自治区南宁市伊岭岩,经广西中医药大学中药鉴定教研室蔡毅教授鉴定为芸香科植物小花山小橘[ Glycosmis citrifolia(Willd.) Lindl.]的叶。取干燥山桔叶药材1 500 g,加8倍量水煎煮3次,提取时间依次为2,1,1 h,提取液滤过合并,滤液浓缩至每克浸膏相当于生药5 g,置冰箱备用。
RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);YLS-6A型智能热板仪(山东省医学科学院设备站);L-204电子天平(梅特勒-托利多中国分公司);TU-1901双光束紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);TGL-16B离心机(上海安亭科学仪器厂)。
1.4.1 对醋酸致小鼠扭体反应次数的影响 取小鼠50只,雌雄各半,随机分为5组,即空白对照组,罗通定组(60 mg·kg-1),山桔叶水提物大(19.5 g·kg-1)、中(9.8 g·kg-1)、小(4.9 g·kg-1)剂量组。均灌胃给药,20 mL·kg-1,qd,连续4 d。空白对照组给予同体积纯净水。末次药后1 h,小鼠腹腔注射0.7%醋酸溶液10 mL·kg-1,记录注射醋酸后15 min内小鼠扭体反应次数[3,4]。
1.4.2 对热板仪致小鼠疼痛的影响 取雌性小鼠,放入(55.0±0.5)℃热板测痛仪,各小鼠自放入到出现舔后足所需时间即为痛阈值,5 min后重复测1次。痛阈<5 s或>30 s者,以及喜跳跃者,弃去不用。小鼠分组及给药同“1.4.1”项,分别在末次药后30,60,90,120 min测定小鼠痛阈。小鼠在热板测痛仪内60 s仍无痛觉反应则取出,按60 s计[3,4]。
1.4.3 对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 取雄性小鼠50只,随机分为5组,即空白对照组,地塞米松组(5.0 mg·kg-1),山桔叶水提物大(19.5 g·kg-1)、中(9.8 g·kg-1)、小(4.9 g·kg-1)剂量组。均灌胃给药,20 mL·kg-1,qd,连续7 d,空白对照组给予同体积纯净水。于末次药后1 h,各组小鼠于右耳廓滴二甲苯20 μL致炎(正、反面各滴10 μL),15 min后脱颈椎处死,直径6 mm打孔器打下左右耳片,称定质量,以两耳片质量差值作为肿胀度,并计算抑制率。抑制率(%)=(空白对照组平均两耳片质量差-给药组平均两耳片质量差) /空白对照组平均两耳片质量差×100%[3,4,5,6,7]。
1.4.4 对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响 分组及给药方法同“1.4.3”项,于末次药后1 h,每只小鼠右后足注射1%角叉菜胶20 μL致炎,致炎后3 h将小鼠脱颈椎处死,于膝关节处剪下两足(剪取后双足相同部位),分别称左、右足质量, 以左、右后足质量差作为肿胀度[7]。
1.4.5 对角叉菜胶致小鼠炎足中前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)含量的影响 分组及给药方法同“1.4.3”项,于末次药后1 h,每只小鼠右后足注射1%角叉菜胶20 μL致炎,致炎后3 h将各小鼠处死,于膝关节处剪下炎足,将各小鼠致炎足剪碎后加入0.9%氯化钠溶液3 mL浸泡24 h,将炎足浸出液3 000 r·min-1离心5 min( r=8 cm),取上清液0.5 mL,加入0.5 mol·L-1 氢氧化钠(NaOH)-甲醇溶液2 mL,置50 ℃恒温水浴锅中20 min,加入甲醇7 mL稀释,空白管亦同上述操作(不加上清液),用紫外可见分光光度计于波长278 nm处测吸光度( A)值[7,8]。
1.4.6 对小鼠腹腔通透性的影响 分组及给药方法同“1.4.3”项,于末次给药后1 h,经小鼠尾静脉注射0.25%伊文思蓝,10 mL·kg-1,腹腔注射0.6%醋酸,10 mL·kg-1,15 min后将小鼠处死,腹腔注入0.9%氯化钠溶液6 mL冲洗,腹腔洗出液2 000 r·min-1离心10 min( r=8 cm),取上清液用紫外-可见分光光度计于590 nm波长处测定吸光度( A)值[3]。
1.4.7 对小鼠棉球肉芽肿的影响 小鼠分组方法同“1.4.3”项,以0.4%戊巴比妥钠麻醉,将2个已高压灭菌且滴加双抗供试液0.1 mL的10 mg棉球分别植入小鼠两侧腋下皮下,缝合切口后外涂碘酒抗感染。次日各鼠均灌胃给药,qd,连续7 d,20 mL·kg-1,空白对照组给予同体积纯净水。末次给药后12 h处死小鼠,剥离肉芽组织棉球,60 ℃烘烤至恒重,精密称定质量,计算肉芽质量。肉芽质量=(带肉芽组织的棉球质量-棉球原始质量)/2[3,6,7]。
1.5 统计学方法 应用SPSS17.0版软件进行统计学分析,计量数据以均数±标准差(
见表1。山桔叶水提物大、中剂量组扭体反应次数明显少于空白对照组,差异有统计学意义( P<0.01或 P<0.05)。提示山桔叶水提物对醋酸致小鼠扭体反应有抑制作用。
| 表1 5组小鼠扭体反应测定结果 Tab.1 Determination results of twisting test on five groups of mice |
见表2。山桔叶水提物大剂量组小鼠30,60,90,120 min痛阈值均明显低于空白对照组,差异有统计学意义( P<0.01, P<0.05);中剂量组小鼠60 min痛阈值明显低于空白对照组,差异有统计学意义( P<0.05);小剂量组小鼠120 min痛阈值明显低于空白对照组,差异有统计学意义( P<0.05)。提示山桔叶水提物可提高热板致小鼠疼痛的痛阈。
| 表2 5组小鼠不同时间痛阈值测定结果 Tab.2 Determination results of pain threshold in five groups of mice at different time points s, |
见表3。山桔叶水提物大、中剂量组耳肿胀度明显低于空白对照组,差异有统计学意义( P<0.01, P<0.05)。提示山桔叶水提物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀有抑制作用。
| 表3 5组小鼠耳肿胀实验结果 Tab.3 Determination results of ear swelling test on five groups of mice |
见表4。山桔叶水提物大、中、小剂量组足肿胀度明显低于空白对照组,差异有统计学意义( P<0.01)。提示山桔叶水提物对1%角叉菜胶致小鼠炎足肿胀有抑制作用。
| 表4 5组小鼠足肿胀度测定结果 Tab.4 Determination results of toe swelling test on five groups of mice mg, |
见表5。山桔叶水提物大、中、小剂量组PGE2含量明显低于空白对照组,差异有统计学意义( P<0.01)。提示山桔叶水提物对1%角叉菜胶致小鼠炎足PGE2有抑制作用。
| 表5 5组小鼠炎足PGE2含量测定结果 Tab.5 Content determination of PGE2 in the inflamed toes of five groups of mice |
见表6。山桔叶水提物大、小剂量组腹腔通透性 A值明显低于空白对照组,差异有统计学意义( P<0.05)。提示山桔叶水提物对0.6%醋酸致小鼠腹腔通透性增加有抑制作用。
| 表6 5组小鼠腹腔通透性吸光度值测定结果 Tab.6 Absorbance value of peritoneal permeability in five groups of mice |
见表7。山桔叶水提物大、中剂量组肉芽质量明显低于空白对照组,差异有统计学意义( P<0.01, P<0.05)。提示山桔叶水提物对小鼠棉球肉芽肿有抑制作用。
| 表7 5组小鼠棉球肉芽质量测定结果 Tab.7 Determination results of cotton ball-induced granuloma in five groups of mice |
疼痛是机体受到不良刺激或损伤后产生的信号和反应,是许多疾病常见的症状。药物的镇痛作用一般以物理性(热、电、机械)或化学性的刺激引发疼痛反应,观察动物对疼痛的反应来定量疼痛,评价药效。冰醋酸致小鼠扭体模型是通过化学试剂刺激造成小鼠腹腔急性炎症反应[9],是筛选非甾体抗炎药镇痛作用的一种敏感、简便的方法。小鼠热板法属于反射性疼痛模型,对仅具有外周镇痛作用的非甾体抗炎药不敏感,是区分麻醉性镇痛药和非甾体镇痛药的有效模型[10]。笔者在本研究采用上述两种疼痛模型,研究山桔叶水提物镇痛作用。实验结果表明,山桔叶水提物大、中剂量对醋酸致小鼠扭体反应次数有抑制作用;大剂量山桔叶水提物组在30,60,90,120 min可提高热板致小鼠疼痛的痛阈;山桔叶水提物中剂量组在60 min可提高热板致小鼠疼痛的痛阈;山桔叶水提物小剂量组小鼠在120 min痛阈值高于空白对照组。
炎症是机体对组织损伤或致病因子侵入所产生的以防御为主的反应。物理、化学、微生物和其他因素都能够引发急性炎症。炎症症状主要表现为红、肿、热、痛。笔者在本实验选用多种急性炎症模型对山桔叶水提物的抗炎作用进行考察。实验结果表明,山桔叶水提物大、中、小剂量山桔叶水提物均可抑制1%角叉菜胶致小鼠炎足肿胀;山桔叶水提物大、中剂量可抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀度及小鼠棉球肉芽肿产生;山桔叶水提物大、小剂量可抑制0.6%醋酸所致小鼠腹腔通透性增加;山桔叶水提物大、中、小剂量可抑制1%角叉菜胶所致小鼠炎足PGE2产生。
本实验结果提示,山桔叶水提物有显著的镇痛作用,其镇痛机制目前仍不清楚,可能同时具有外周和中枢镇痛作用,需要进一步实验论证;山桔叶水提物有显著的抗炎作用,对炎症的渗出、水肿及炎症递质PGE2等有很好的拮抗作用。
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