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王睿, 邱智东, 石薇, 赵红迪, 董雪莲. .反相高效液相色谱法测定人参固体发酵产物三种人参皂苷含量[J]. 医药导报, 2016,35(3): 288-290
.[J]. HERALD OF MEDICINE,2016,35(3): 288-290  
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反相高效液相色谱法测定人参固体发酵产物三种人参皂苷含量
王睿, 邱智东, 石薇, 赵红迪, 董雪莲
长春中医药大学研究生学院,长春 130117

作者简介: 王睿(1989-),女,吉林四平人,在读硕士,研究方向:中药制剂。E-mail:674380658@qq.com。

通信作者: 董雪莲(1979-),女,助教,硕士,研究方向:中药制剂。电话:0431-86172049,E-mail:dongxuelian1979@126.com。

收稿日期: 2014-09-05 修回日期: 2014-10-26
基金: 国家科技支撑计划(2012BA129B00);
摘要

目的 建立经固体发酵转化前后人参中人参皂苷R0、Rb2、Rd的含量测定方法。方法 采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法,色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液,梯度洗脱;柱温为30 ℃,检测波长203 nm,流速为1.0 mL·min-1,进样量10 μL。结果 发酵前人参皂苷R0、Rb2、Rd加样回收率分别为100.03%,98.11%,99.29%,RSD分别为0.53%,0.70%,0.57%;发酵后人参皂苷R0、Rb2、Rd加样回收率分别为98.55%,98.44%,98.31%,RSD分别为2.39%,2.47%,2.77%,符合相关标准。结论 该方法简便、准确、重复性好,可用于人参固体发酵产物中人参皂苷R0、Rb2、Rd的含量测定。

关键词: 人参; 人参皂苷; 色谱法; 高效液相; 反相; 含量测定
中图分类号:R286 文献标志码:B 文章编号:1004-0781(2016)03-0288-03 doi: 10.3870/j.issn.1004-0781.2016.03.019
Fund:
Abstract
Keyword:

人参是五加科多年生草本人参( Panax ginseng C.A.Meyer)的干燥根[1],含多种活性成分。笔者以人参为底物,进行固体发酵的生物转化研究,从而提高原本在人参药材中含量甚微的人参皂苷R0、Rb2、Rd的含量,以提高其药效价值。笔者在本实验中通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)法对固体发酵前后人参皂苷R0、Rb2、Rd含量对比,以期为人参固体发酵研究提供实验数据。

1 仪器与试药
1.1 仪器

岛津LC-15C高效液相色谱仪。

1.2 试药

人参皂苷R0对照品(批号:111903,含量:98%);人参皂苷Rb2(批号:111715,含量:93.8%);人参皂苷Rd(批号:111818,含量:94.2%)购自中国食品药品检定研究院。所用流动相乙腈为色谱纯;水为超纯水;其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果
2.1 色谱条件

Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为乙腈(A)-0.4%磷酸溶液(B),按表1梯度洗脱,柱温为30 ℃,检测波长为203 nm,流速为1.0 mL·min-1,进样量10 μL。

表1 RP-HPLC流动相洗脱梯度 %
2.2 对照品溶液的制备

精密称取人参皂苷R0、Rb2、Rd对照品适量,置量瓶中,加入甲醇溶解,制成含人参皂苷R0为0.165 0 mg·mL-1、Rb2为0.170 3 mg·mL-1、Rd为0.156 0 mg·mL-1的对照品混合溶液。

2.3 供试品溶液的制备

人参药材:取人参药材粉末[过筛孔内径(250±9.9) μm]1 g,精密称定,置索氏提取器中,加三氯甲烷加热回流3 h,弃去三氯甲烷溶液,药渣挥干溶剂,连同滤纸筒移入100 mL锥形瓶。精密加水饱和正丁醇50 mL,密塞,放置过夜,超声处理(功率250 W,频率50 kHz)30 min,滤过,弃去初滤液。精密量取续滤液25 mL,置蒸发皿中蒸干,残渣加甲醇溶解并转移至5 mL置瓶,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得[2]。

人参固体发酵产物:D101大孔树脂湿法装柱,75%乙醇溶液洗脱,所得洗脱液挥干溶剂,取干燥粉末1 g,加甲醇置50 mL量瓶中定容,超声处理30 min,过滤,取续滤液,即得。

2.4 标准曲线的绘制

取对照品混合溶液,分别进样2,5,8,10,15,20 μL。按上述色谱条件,以峰面积为纵坐标( Y),进样量(μg)为横坐标( X),进行线性回归。由表2可看出,呈良好线性关系。

表2 人参皂苷R0、Rb2、Rd的回归方程
2.5 精密度实验

对照品混合溶液分别进样6次,每次10 μL,在规定的色谱条件下,记录各色谱峰面积,计算RSD。人参皂苷R0、Rb2、Rd的RSD分别为0.47%,0.93%,0.24%( n=6)。

2.6 稳定性实验

取适量上述2种供试品,分别按照供试品溶液的制备方法同时制成6份供试品溶液,按照上述色谱条件测定,分别于0,4,8,12,24,36 h进样,进样10 μL,以峰面积计算。发酵前人参皂苷R0、Rb2、Rd的RSD分别为0.97%,0.62%,1.21%( n=6);固体发酵后人参皂苷R0、Rb2、Rd的RSD分为0.95%,0.82%,1.13%,表明2种供试品在36 h内稳定性良好。

表3 发酵前人参皂苷R0、Rb2、Rd加样回收率 mg
2.7 重复性实验

取上述2种供试品分别制成6份供试品溶液,按上述色谱条件,依法测定,计算供试品中人参皂苷R0、Rb2、Rd的含量,以考察该法的重复性。测定结果,发酵前人参皂苷R0、Rb2、Rd的RSD分别为0.91%,1.14%,1.06%( n=6);固体发酵后人参皂苷R0、Rb2、Rd的RSD分别为1.13%,0.69%,0.58%( n=6),表明发酵前人参药材以及固体发酵后的供试品重复性良好。

2.8 加样回收率实验

称取适量供试品6份,分别加入适量人参皂苷R0、Rb2、Rd对照品,依法测定,计算加样回收率。其发酵前平均回收率,人参皂苷R0为100.03%、Rb2为98.11%、Rd为99.29%,RSD分别为0.53%,0.70%,0.57%;发酵后平均回收率,人参皂苷R0为98.55%、Rb2为98.44%、Rd为98.31%,RSD分别为2.39%,2.47%,2.77%,符合相关标准[3]。见表3,表4。

表4 发酵后人参皂苷R0、Rb2、Rd加样回收率 mg
2.9 含量测定

在上述2种供试品中分别取3批样品,按照上述含量测定方法分别测定并计算含量,结果显示,发酵前人参中人参皂苷R0、Rb2、Rd的平均含量分别为0.501 4,0.773 9,0.324 6 mg·g-1,固体发酵后样品中人参皂苷R0、Rb2、Rd平均含量分别为32.821 9,34.029 8,70.605 9 mg·g-1[4,5](见图1~3)。

图1 人参皂苷R0、Rb2、Rd对照品HPLC图

图2 人参药材HPLC图

图3 固体发酵后样品HPLC图

3 讨论

本品采用固体发酵生物转化技术,对人参药材进行固体发酵,通过实验可以看出,人参皂苷R0、Rb2、Rd在人参药材中含量稀少,通过固体发酵人参皂苷R0、Rb2、Rd的含量明显升高,通过生物转化技术构建人参新型发酵组合物,活性成分得以优化;获得具有物质基础均一稳定的新型原料药,解决目前中药开发多数局限于从现有中药中寻找有效成分的问题;同时以人参固体发酵产物为原料,利用现代技术提取纯化其有效部位,工艺简单、成本低廉,为开发中药新药提供一新的思路及方法,利用本课题生物转化技术可行有效,对于临床应用有积极意义[6]。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 黄兆胜. 中药学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2002: 424. [本文引用:1]
[2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部)[M]. 北京: 中国医药科技出版社2010: 8. [本文引用:1]
[3] 王青, 袁萍, 茅仁刚, 等. HPLC法测定三七发酵产物中人参皂苷Rg3含量的变化[J]. 中华中医药学刊, 2011, 29(7): 2063-2064. [本文引用:1]
[4] 张震军. HPLC-UV - ELSD 测定复方丹参滴丸中6种成分含量[J]. 医药导报, 2014, 33(10): 1375-1379. [本文引用:1]
[5] 张国华, 李绍平, 万建波, 等. RP-HPLC法测定三七总皂苷注射液中9种皂苷的含量[J]. 药物分析杂志, 2005, 9(9): 664-665. [本文引用:1]
[6] 邹昆, 何正有, 王欣荣, 等. 人参皂苷的微生物转化研究进展[J]. 国外医药(抗生素分册), 2012, 33(3): 104-108. [本文引用:1]