.[J]. HERALD OF MEDICINE,2016,35(3): 302-305
作者简介: 王青晓(1980-),女,河南洛阳人,主管药师,硕士,从事中药检验、分析与质控研究。电话:0371-63388285,E-mail:wangqingxiao@126.com。
通信作者: 刘瑞新(1980-),男,河南商丘人,副主任药师,博士,从事中药药剂及其质控分析研究。电话:0371-66233562,E-mail:liuruixin7@163.com。
目的 改进香砂养胃丸(水丸)质量标准。方法 针对原标准存在的部分药材显微鉴别特征不易观察、部分药材薄层鉴别展开剂毒性大、缺少主要药味的薄层鉴别和含量测定项目等问题,基于厂家提供的10批样品,改进其质量控制标准。结果 删去白术和砂仁的显微鉴别项目,替换香附薄层鉴别展开剂中的毒性试剂,增加甘草的薄层鉴别项目,增加陈皮、枳实中橙皮苷的高效液相色谱(HPLC)含量测定项目。结论 改进后的方法快速、准确,能够更有效控制香砂养胃丸(水丸)质量。
香砂养胃丸(水丸)收载于2010年版《中华人民共和国药典》,由木香、砂仁、白术、陈皮、茯苓、半夏、醋香附、枳实、豆蔻、姜厚朴、广藿香、甘草等12味中药组成,具有温中和胃作用,临床用于治疗不思饮食、呕吐酸水、胃脘胀满等消化道症状,是治疗消化道疾病最常用的药物之一[1,2,3,4,5]。
目前该制剂的质量标准中,部分检验方法存在不足,如部分药材显微鉴别特征不易观察、部分药材薄层鉴别展开剂毒性大、缺少主要药味的薄层鉴别和含量测定项目等问题。为改进和完善香砂养胃丸(水丸)的质量标准,笔者按照《中华人民共和国药典》2010年版一部附录ⅩⅧ“中药质量标准分析方法验证指导原则”和2010年标准提高科研立项综合意见单中要求的项目,逐一研究,并对其进行修订,主要内容包括删去白术和砂仁的显微鉴别项目,替换香附薄层鉴别展开剂中的毒性试剂,增加甘草的薄层鉴别项目,增加陈皮、枳实中橙皮苷的含量测定项目,从而更好地控制其质量,保证该制剂在临床应用中安全有效。
Waters2695高效液相色谱仪-Waters2998二极管阵列检测器,Waters2695高效液相色谱仪-Waters2487紫外检测器,Agilent1100高效液相色谱仪,KQ-300型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。
甘草对照药材(批号:120904-200512)、橙皮苷对照品(批号:110721-200512,含量:95.3%)、甘草苷对照品(批号:111610-200604,含量:93.7%)均来自于中国食品药品检定研究院。乙腈(德国Merck公司,色谱纯,批号:JA029030),水为纯净水。香砂养胃丸(水丸)样品:由10家药品生产企业提供,批号分别为100701,20100101,D120064,100302,20090201,20090403,WJ630825,100401,100601,100402。
原标准中“鉴别(1)”为显微鉴别项,经对收集到的10批样品进行显微特征检验,发现原标准中规定应检出的白术的“草酸钙针晶细小,长10~32 μm,不规则地充塞于薄壁细胞中”与砂仁的“内种皮细胞中胞腔含硅质块”显微特征不易观察到,根据“《中华人民共和国药典》中药质量标准研究制定技术要求”中要求“标准中的显微特征应易于检出,对出镜率低于60%的(制片5张,可检出规定特征的应不少于3张),可不作正文规定”,因此删除白术和砂仁的显微鉴别,其余显微特征仍按《中华人民共和国药典》2010年版一部中香砂养胃丸项下标准,未作修改。
笔者考察了《中华人民共和国药典》2010年版一部中香砂养胃丸标准的展开条件,根据“《中华人民共和国药典》中药质量标准研究制定技术要求”中要求“实验中应注重绿色环保要求,尽量采用毒害小、污染少的试剂、试药,避免使用苯等毒性大的溶剂;并尽量采用《中华人民共和国药典》附录中已收载的试剂与试液”,因此本实验通过薄层方法学研究,将鉴别(3)项下的展开剂中的苯用甲苯替代,减小有机试剂对试验操作人员的毒害及对环境的污染。
取本品9 g,加乙醇40 mL,超声处理30 min,放冷,滤过,滤液蒸干,残渣加水15 mL使溶解,用乙醚振摇提取3次,每次15 mL,弃去乙醚液,水液用乙酸乙酯振摇提取3次,每次15 mL,合并乙酸乙酯液,加无水硫酸钠6 g,振摇3 min,放置,取乙酸乙酯液,蒸干,残渣加乙醇0.5 mL使溶解,作为供试品溶液。取甘草对照药材1 g,加乙醇20 mL,超声处理30 min,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇1 mL使溶解,作为对照药材溶液。另取甘草苷对照品,加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液,作为对照品溶液。取相应量的缺甘草的阴性样品,同法制成阴性对照溶液。吸取供试品溶液及阴性对照溶液各5 μL,甘草对照药材溶液及甘草苷对照品溶液各1 μL,分别点于同一含4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板,以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1:1:2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,105 ℃加热至斑点显色清晰,置紫外光灯(365 nm)下检视。结果表明,10批样品斑点清晰,重复性好,方法可行(图1)。
 | 图1 香砂养胃丸中甘草的薄层色谱 |
2.4.1 色谱条件 Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:乙腈-0.2%磷酸溶液(18:82);柱温30 ℃;流速1.0 mL·min-1;检测波长:284 nm;理论板数按橙皮苷峰计算应不低于2 000。
2.4.2 溶液的制备 供试品溶液的制备:取本品适量,研细,取约0.5 g,精密称定,置锥形瓶中,精密加甲醇50 mL,称定质量,加热回流1 h,放冷,再称定质量,加甲醇补足减失质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
对照品溶液的制备:取橙皮苷对照品适量,加甲醇制成每毫升含0.2 mg的溶液,即得。
阴性对照溶液的制备:按处方比例制备缺陈皮、枳实的阴性样品,按供试品溶液制备方法制成阴性溶液。
2.4.3 方法学验证 ①线性关系考察:取橙皮苷对照品适量精密称定,置量瓶中,加甲醇制成每毫升含208.4 μg的溶液,分别精密吸取此对照品溶液各0.5,1,2,2.5,3,4,5,6,7,8,9,10 μL,分别注入液相色谱仪,测定,以色谱峰面积积分值( Y)对进样量( X,ng)回归,得线性方程 Y=1.609 X+79.649, r=0.999 5,表明橙皮苷在104.2~2 084.0 ng范围,进样量与峰面积积分值呈良好的线性关系。
②准确度考察:取批号为100402的样品(橙皮苷含量9.88 mg·g-1)6份,每份约0.125 g,精密称定,置锥形瓶中,精密加入含54.92 μg·mL-1的橙皮苷对照品溶液25 mL,按“2.4.2”项方法制备加样供试品溶液。精密吸取加样供试品溶液,分别注入液相色谱仪,按照“2.4.1”项方法测定橙皮苷含量,计算回收率,见表1。平均回收率98.36%,RSD=1.87%。
③精密度考察:考察重复性。取批号为100601的样品6份,按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液,依法测定橙皮苷的含量,结果橙皮苷含量RSD为1.1%。
④专属性考察:分别吸取橙皮苷对照品溶液、供试品溶液以及缺陈皮、枳实的阴性溶液各10 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图。在与对照品色谱峰相应的位置上,供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰,阴性溶液无干扰(图2)。
 | 图2 3种溶液的HPLC图（A.阴性样品;B.对照品;C.样品;1.橙皮苷） |
⑤精密度范围:取批号为100601的样品,取样量分别为0.25,1 g,每组分别称取6份,共计12份,按照“2.4.2”项方法制备供试品溶液,依法测定橙皮苷含量,结果两组橙皮苷含量的RSD分别为3.2%和1.1%,表明样品在50%~150%范围内测定结果的精密度良好。
⑥耐用性考察:取批号为100402的样品,按含量测定项下方法,制备供试品溶液,分别在0,2,4,6,10 h进样一次,每次进样10 μL,测定橙皮苷的峰面积,结果峰面积RSD为0.2%;考察3根不同商品规格的色谱柱(包括Lichrospher08111105柱、Uitimate210701677柱、AgilentUSCL023711柱),测定同一样品,结果测得含量的RSD为1.9%。
 | 表1 橙皮苷加样回收实验结果 mg |
2.4.4 含量测定 取本品10批,分别制备供试品溶液,精密吸取供试品溶液10 μL,注入液相色谱仪测定,计算橙皮苷含量,结果见表2。
| 表2 10批样品含量测定结果 mg·g-1 |
制备供试品溶液时,用乙醇直接超声提取,结果杂质太多影响鉴别;用水饱和正丁醇提取,过中性氧化铝柱及用乙醇直接超声提取,过D101型大孔树脂柱,结果发现,杂质少,甘草的特征斑点也随之消失;最终选用“2.3”项的供试品制备方法,结果斑点清晰,方法可行。
分别吸取橙皮苷对照品溶液、供试品溶液各10 μL注入液相色谱仪,对橙皮苷峰在190~550 nm波长范围内进行光谱扫描,橙皮苷对照品溶液及供试品溶液主峰光谱最大吸收波长一致,最大吸收波长分别为283.1,328.4 nm,参照《中华人民共和国药典》2010年版一部香砂养胃颗粒含量测定项下橙皮苷的含量测定波长[6],选定检测波长为284 nm。
3.3.1 提取溶剂的选择 取批号为100402的样品,分别采用①甲醇超声提取40 min;②石油醚超声提取除杂后甲醇超声提取40 min;③乙醇超声提取40 min3种方式进行实验,用HPLC法测定橙皮苷含量,橙皮苷的含量分别为8.470,8.043,1.414 mg·g-1,结果表明甲醇为溶剂提取的方法效果最好。
3.3.2 提取方式选择 取批号为100402的样品,分别采用甲醇超声提取1 h、甲醇索氏提取至无色、甲醇回流1 h进行实验,采用HPLC法测定橙皮苷含量,橙皮苷的含量分别为8.946,10.361,9.711 mg·g-1,结果表明,索氏提取时间较长,回流提取效率较高,因此选用回流提取。
3.3.3 提取时间考察 取批号为100402的样品,精密称取3份,各精密加入甲醇50 mL,分别加热回流30 min,1 h,2 h,3 h,HPLC法测定橙皮苷含量,橙皮苷的含量分别为11.067,11.657,11.316,11.802 mg·g-1,回流提取1,2,3 h含量变化不大,选定提取时间为1 h。
3.3.4 提取溶剂用量选择 取批号为100402的样品,精密称取3份,质量分别为6,1,0.5 g,分别精密加入17,50,100倍甲醇加热回流1 h,用甲醇补足减失的质量,HPLC法测定橙皮苷含量,橙皮苷的含量分别为9.711,10.527,10.758 mg·g-1。结果表明,甲醇用量为100倍时,可以将有效成分提取完全。
2010年版《中华人民共和国药典》规定,陈皮饮片含橙皮苷(C28H34O15)不得少于2.5%,陈皮饮片的水分限度为13%,枳实的水分限度为15%;不同文献报道不同来源的枳实中橙皮苷的含量范围为1.2%~16.6%。按枳实含橙皮苷5.0%,根据香砂养胃丸处方,本品每克含陈皮药材为0.076 g,含枳实药材为0.109 g,计算出本品中橙皮苷的含量限度为(0.076 g×2.5%×87%+0.109 g×5.0%×85%)×1 000=6.29 mg·g-1。对于本品,由“2.4.5”项结果可知,10批样品中橙皮苷的平均含量为18.96 mg·g-1,转移率为301.4%,因此含量限度定为理论含量限度的80%,即6.29×80%=5.03 mg·g-1。本品含量限度定为“本品每1 g含陈皮和枳实以橙皮苷(C28H34O15)计,不得少于5.0 mg”。
为了建立一种准确、可行且具备普遍适用性和规范性的香砂养胃丸(水丸)的质量标准,笔者在本实验中进行了较全面的实验研究,并依据《中华人民共和国药典》2010年版一部附录ⅩⅧ“中药质量标准分析方法验证指导原则”进行了较细致的方法学验证,证明该法准确可靠,可作为该制剂的质量控制方法。
(志谢:感谢河南省食品药品检验所中药室代雪平、申二永、李彦超、李海燕、王艳伟等老师为本文所付出的努力!)
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