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日本科学技术振兴机构数据库（JST）
第七届湖北十大名刊提名奖
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目的
探讨石菖蒲-远志药对不同组分(挥发油、水提物)对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠海马磷酸化Tau蛋白Ser396位点和Tau-5的影响。
方法
SD雄性大鼠,随机分为8组,即正常对照组,模型对照组,石菖蒲-远志挥发油小、中、大剂量组,石菖蒲-远志水提物小、中、大剂量组。用D-半乳糖制作亚急性衰老模型,造模成功后治疗组大鼠分别给予石菖蒲-远志不同组分0.6,1.2,1.8 g·kg-1(生药用量)灌胃,正常对照组和模型对照组分别0.9%氯化钠溶液灌胃。给药28 d后,用免疫印迹和免疫组化法检测各组大鼠海马磷酸化Tau蛋白Ser396位点和Tau-5水平。
结果
模型对照组与正常对照组比较,Tau蛋白Ser396位点磷酸化水平明显上升(P<0.01);模型对照组,石菖蒲-远志挥发油小、中、大剂量组,石菖蒲-远志水提物小、中、大剂量组Tau蛋白Ser396相对表达分别为3.83±0.10,3.35±0.01,3.11±0.01,2.75±0.03,2.93±0.01,2.55±0.07,2.23±0.08;石菖蒲-远志药对两种组分均可使AD模型大鼠海马内Tau蛋白Ser396位点发生不同程度去磷酸化,且呈剂量依赖性,水提物组分略优于挥发油组分,尤其大剂量组明显(P<0.01),但Tau-5无明显变化(P>0.05)。
结论
石菖蒲-远志药对能促进AD模型大鼠海马内Tau蛋白Ser396位点去磷酸化,尤以水提物组分效果明显。
Objective
To investigate the different components of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia (volatile oil, aqueous extract) on the expression of phosphorylated Tau protein at site Ser396 and Tau-5 in the hippocampus of rats with Alzheimer's disease (AD).
Methods
Male Sprague Dawley rats were randomly divided into 8 groups: normal control group, model control group, low-, middle-, and high-dose groups of volatile oil of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia, and low-, middle-, and high-dose groups of aqueous extract of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia.The subacute aging model was established by intraperitoneal injection of D-galactose (D-gal).Rats were given different components of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia (crude drug dosage, 0.6,1.2,1.8 g·kg-1) in experimental groups, and 0.9% sodium chloride solution in normal control group and model control group, by gavage for 28 days.The levels of phosphorylated Tau protein at site Ser396 and Tau-5 were detected in hippocampal tissues by Western blotting and immunohistochemistry.
Results
The levels of phosphorylated Tau protein at site Ser396 were significantly enhanced in the model control group, as compared with those in normal control group (P<0.01).The relative expression levels of Tau protein Ser396 were 3.83±0.10,3.35±0.01,3.11±0.01,2.75±0.03,2.93±0.01,2.55±0.07,and 2.23±0.08 in model control group, low-, middle-, and high-dose groups of volatile oil of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia, and low-, middle-, high-dose groups of aqueous extract of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia,respectively.Two components of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia could dephosphorylate Tau protein Ser396 to vary degrees in a dose-dependent manner.The aqueous extract component was slightly better than the volatile oil component, especially in the high-dose group (P<0.01).But Tau-5 did not change significantly after treatment with Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia (P>0.05).
Conclusion
Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia could promote the dephosphorylation of Ser396 site of Tau protein in the hippocampus of AD rats, with the aqueous extract component having better effects.
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是常见的神经退行性疾病之一,属中医“呆证”范畴[1],神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)是其主要病变之一。AD患者的Tau蛋白被异常过度磷酸化,并以配对螺旋丝结构形成NFTs在细胞内聚积[2],因而Tau蛋白高度磷酸化是引起AD神经元纤维退行性改变的主要变化[3]。石菖蒲-远志是中医治疗老年性痴呆方剂中出现频次最高的药对[4]。大量实验已证实两药单用或配伍使用均能增强AD大鼠的学习记忆能力[5-10],但其深入机制还有待明确。笔者观察石菖蒲-远志药对不同组分对Tau蛋白Ser396位点磷酸化水平和Tau-5表达的影响,以期探讨该药对不同组分益智抗衰的可能机制。
雄性SD大鼠80只,无特定病原体级,体质量(200±20)g。购自武汉大学动物实验中心,动物生产许可证号:SCXK(鄂)2014-0004,动物质量合格证书号:42000600001546。大鼠分笼饲养于(22±2) ℃恒温环境,日照/黑暗时间为12 h/12 h,自由摄食和饮水。
石菖蒲(Acori tatarinowii rhizoma)、远志(Polygalae radix)均购于湖北顺天医药有限公司(批号:130501,130601),由湖北中医药大学药学院生药教研室张秀桥教授鉴定,分别为江苏天南星科植物石菖蒲(Acorus tatarinowii Schott)的干燥根茎、山西远志科植物远志(Polygala tenui folia Willd)的干燥根;丙烯酰胺(amresco,0341)、甲叉双丙烯酰胺(amresco,0712);磷酸酶抑制剂、苯甲基磺酰氟、放射免疫分析裂解液、二辛可宁酸蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术公司,S1873、ST506、P0013B、P0010);p-Tau(Ser396)(Santa Cruz,sc-101815)、Tau-5(abcam,ab80579);甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体(杭州贤至生物有限公司,AB-P-R001);辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠二抗、羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司,BA1051、BA1054);电化学发光底物液(Thermo,XBT-1);显影定影试剂盒(武汉巴菲尔生物有限公司);苏木精(Sigma,H9627);免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司,PV-9000);二氨基联苯胺显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司,AR1022);Tau(phospho S396)(abcam,ab109390);其他试剂均为国产分析纯。
旋转蒸发仪(RE-52AA,上海亚荣生化仪器厂),SHZ-D(Ⅲ)型循环水真空泵(天津华鑫仪器厂),病理切片机(德国Leica RM 2016轮转式切片机),切片刀(日本羽毛R35一次性刀片),组织摊烤片机(武汉俊杰JK-6生物组织摊烤片机),抗原修复用微波炉[美的KJ23B(C)-AN],显微镜(尼康E100型生物显微镜),数码单反相机(佳能600D),水平摇床(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司),电泳仪、垂直电泳槽、电转仪(北京六一仪器厂)。
1.4.1 石菖蒲-远志药对不同组分(挥发油、水提物)的制备
石菖蒲-远志药对挥发油制备:按《中华人民共和国药典》挥发油乙法测定[11],称取经粉碎过孔径0.850 mm筛(20目)的石菖蒲与远志药材各150 g(即1:1),置于5 L圆底烧瓶内,加水2 400 mL,振摇混合后,连接挥发油测定器与回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分,并溢流入烧瓶时为止。置电热套中缓缓加热至沸,保持微沸5 h,至测定器中油量不再增加,停止加热。放置1 h,冷却,油层上端与刻度0线齐平,读取体积,计算含量,收集保存。灌胃前取挥发油适量,用1%聚山梨酯-80稀释100倍备用。
石菖蒲-远志药对水提物的制备:将以上收集挥发油后的水提液和药渣用纱布过滤,收集药液备用。药渣中再加入4倍量(1 200 mL)水,从开始滴下液滴计时,保持微沸,提取完毕后,取出烧瓶,放置,冷却,过滤,第2次加2倍量水,同法操作,合并以上几次的药液。将药液转移至旋转蒸发仪,于75 ℃减压回收水,浓缩至1 g·mL-1生药量的药液。
上述提取物按比例制备足够数量,保存在-20 ℃冰箱中,临用时取出。为确保实验结果的可比性,同一样品的所有实验都用同一批药材。
1.4.2 动物分组、造模及给药
将SD大鼠适应性喂养1周,其中72只腹腔连续注射D-半乳糖6周造模[12],给药剂量为125 mg·kg-1·d-1;另8只为正常对照组。造模后3 d用Morris水迷宫训练5 d,第6天选取空间学习记忆功能低下者为痴呆大鼠,共计58只。分组(水提物及挥发油大剂量组各9只,其余各组每组8只):正常对照组(0.9%氯化钠溶液腹腔注射6周后用0.9%氯化钠溶液灌胃);模型对照组(0.9%氯化钠溶液灌胃);石菖蒲-远志挥发油小、中、大剂量组(石菖蒲-远志挥发油小、中、大剂量灌胃);石菖蒲-远志组(石菖蒲-远志水提物小、中、大剂量灌胃),各组分别给药28 d。小、中、大剂量分别为0.6,1.2,1.8 g·kg-1(生药用量),以200 g大鼠为例,挥发油得率为1%即100 g生药得挥发油1 000 μL,用量0.6 g·kg-1×0.2 kg×1 000 μL÷(100 g)=1.2 μL,挥发油用1%聚山梨酯-80稀释100倍灌胃,即120 μL;水提物浓度为1 g·mL-1生药量,灌胃量为120 μL,灌胃时均采用1 mL注射器,16号9 cm(直)针头。
1.4.3 免疫印迹分析各组大鼠海马内p-Ser396、Tau-5蛋白表达
末次给药3 h后将大鼠深度麻醉(10%水合氯醛3.5 mL·kg-1),断头取海马组织,冰上匀浆,超声粉碎后4 ℃、12 000 r·min-1(r=8 cm)高速离心15 min,取上清液,二辛可宁酸法测蛋白浓度,用8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺进行电泳,将蛋白转至聚偏二氟乙烯膜,将聚偏二氟乙烯膜置于含5%脱脂奶粉、0.05%聚山梨酯-20的三羟甲基氨基甲烷溶液(封闭液)封闭2 h。分别加入一抗(Ser396:1:500,Tau-5:1:600)和相应的二抗(1:5 000)室温摇床孵育2 h。洗膜后在适量电化学发光底物液孵育数分钟。待荧光带明显后,用滤纸吸去多余的底物液,覆上保鲜膜,X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影。BandScan分析胶片灰度值,每组重复3次,各组均以正常对照组为标准。
1.4.4 免疫组化染色分析各组大鼠海马CA1区p-Ser396、Tau-5表达
大鼠经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(50 mg·kg-1·mL-1),施行左心室-主动脉灌注,先用0.9%氯化钠溶液快速冲洗血液,再用含4%多聚甲醛的0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液(PBS,pH值7.4,4 ℃)继续灌流,待充分固定后,迅速取脑,并置于上述相同固定液中4 ℃后固定过夜。取出脑组织后,水洗,包埋,切片脱蜡,置Leica冰冻切片机切片,片厚7~8 μm,隔5张取1张贴片,-20 ℃冰箱保存。
切片采用微波进行抗原修复,将脱蜡水化后的组织切片置于修复盒中的不锈钢切片架上,加适量的修复液(0.01 mol·L-1枸橼酸缓冲液,pH值6.0),微波炉可先用高档加热使液体沸腾,当加热至沸腾时调到中档,此时开始计时,修复时间10~15 min。再放入冷水中冷却至室温后取出切片,用PBS(pH值7.4)冲洗,将配制好的3%过氧化氢滴加于切片组织上以阻断内源性过氧化物酶,室温孵育15 min,PBS冲洗。加一抗(p-Ser 396,稀释比1:1 000)于4 ℃湿盒中孵育过夜。次日PBS冲洗后滴加试剂1(聚合物辅助剂),37 ℃孵育20 min。PBS冲洗后滴加试剂2(辣根过氧化物酶标记二抗IgG多聚体),37 ℃孵育25 min。PBS冲洗切片4次,每次3 min,甩去PBS液,吸水纸擦干切片,每张切片滴加新鲜配制的DAB显色液,显微镜下观察,阳性信号为棕黄色或棕褐色,用自来水冲洗切片终止显色,复染、脱水、封片,晾干后镜检并采集图像。
p-Tau(Ser396)和Tau-5免疫阳性细胞在光镜下见细胞质和突起内有棕黄色阳性颗粒,细胞核为阴性。免疫组化阳性细胞的计算方法:每只大鼠取切片3张,光镜下每张切片计数3个视野(×400)的阳性细胞,总和除以3作为该大鼠阳性细胞数。
1.4.5 统计学方法
使用SPSS13.0版统计软件进行统计分析,实验数据以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
与正常对照组比较,模型对照组p-Tau(Ser396)蛋白表达的灰度值明显增强,说明D-半乳糖致衰后,海马内396位点的Tau蛋白磷酸化含量明显上升(P<0.05)。石菖蒲-远志药对不同组分小、中、大剂量组与模型对照组比较,蛋白磷酸化有不同程度降低,说明石菖蒲-远志药对不同组分均可降低AD模型大鼠海马内p-Tau(Ser396)蛋白含量(P<0.05或P<0.01),且水提物组略优于挥发油组(P<0.05),但8组大鼠海马内Tau-5无明显变化(P>0.05),见
图1
8组大鼠海马内p-Ser396、Tau-5蛋白表达
A.normal control group;B.model control group;C1.low-dose volatile oil group of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia;C2.medium-dose volatile oil group of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia;C3.high-dose volatile oil group of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia;D1.low-dose aqueous extract group of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia;D2.medium-dose aqueous extract group of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia;D3.high-dose aqueous extract group of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia
Fig.1 Expression of p-Ser396 and Tau-5 in the hippocampus of eight groups of rats
表1 8组大鼠海马内p-Ser396、Tau-5表达的比较
Tab.1 Comparison of the expression of hippocampal p-Ser396 and Tau-5 among eight groups of rats ±s,n=3
与正常对照组比较,模型对照组p-Tau(Ser396)阳性表达的细胞数明显增加,说明D-半乳糖致衰后,海马CA1区396位点的Tau蛋白磷酸化程度明显增强(t=21.357 9,P<0.01)。石菖蒲-远志药对不同组分小、中、大剂量组与模型对照组比较,396位点的Tau蛋白磷酸化均有不同程度降低,说明石菖蒲远志药对不同组分均可降低AD模型大鼠海马CA1区p-Tau(Ser396)阳性细胞数量,以水提物大剂量效果更明显(t=10.174 8,P<0.01),与挥发油各剂量组比较,水提物小、中剂量组差异无统计学意义(P>0.05),但水提物大剂量组优于挥发油大剂量组(t=3.117 9,P<0.05),而总Tau(Tau-5)无明显变化(P>0.05),见
图2
8组大鼠海马CA1区p-Ser396表达的病理特征(×400)
A.normal control group;B.model control group;C1.low-dose volatile oil group of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia;C2.medium-dose volatile oil group of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia;C3.high-dose volatile oil group of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia;D1.low-dose aqueous extract group of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia;D2.medium-dose aqueous extract group of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia;D3.high-dose aqueous extract group of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia
Fig.2 Pathology characteristic of p -Ser396 express in hippocampal CA1 region of eight groups of rats(×400)
图3
8组大鼠海马CA1区Tau-5表达的病理特征(×400)
A正常对照组;B.模型对照组;C1.石菖蒲-远志挥发油小剂量组;C2.石菖蒲-远志挥发油中剂量组;C3.石菖蒲-远志挥发油大剂量组;D1.石菖蒲-远志水提物小剂量组;D2.石菖蒲-远志水提物中剂量组;D3.石菖蒲-远志水提物大剂量组
Fig 3
Pathological characteristic of Tau-5 expression in hippocampus CA1 region of eight groups of rats(×400)
A.normal control group;B.model control group;C1.low-dose volatile oil group of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia;C2.medium-dose volatile oil group of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia;C3.high-dose volatile oil group of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia;D1.low-dose aqueous extract group of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia;D2.medium-dose aqueous extract group of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia;D3.high-dose aqueous extract group of Acorus tatarinowii and Polygala tenuifolia
AD 属于中医“呆证”“健忘”等范畴[1],其发病与虚、痰、瘀三者相关,从“痰”论治是古今常用治法。远志为远志科多年生草本植物远志和卵叶远志的根,具有宁心安神、祛痰开窍的功效,首见于《神农本草经》。李时珍在《本草纲目》称其“服之能益智强志,故有远志之称”。孙思邈将其列为益智方药的第一味。石菖蒲为天南星科多年生草本植物石菖蒲的根茎,功善宣气除痰,开窍醒神。石菖蒲和远志配伍使用,是临床治疗“呆证”的常用药对。笔者前期体外实验证实,石菖蒲-远志药对的挥发油和水提物成分作用于N2a/wt细胞后能通过提高BCL-2的表达,降低casepse3蛋白表达水平来抑制细胞凋亡,包括早期和中晚期细胞凋亡,其中水提物组作用优于挥发油组。
Tau蛋白是神经元中含量最高的微管相关蛋白,其经典生物学功能是促进微管组装和维持微管的稳定性[13]。Tau蛋白功能主要受磷酸化调节,作为一种磷蛋白,在体内外均可被多种蛋白激酶和磷酸酯酶作用,改变其磷酸化状态[14-15]。研究表明,Tau蛋白异常在AD患者神经变性和学习记忆障碍的发生发展中起重要作用。在AD患者脑中,Tau蛋白被异常过度磷酸化,失去生物学功能,并自身聚合为成对螺旋细丝,从而形成AD特异性病理改变——NFTs[16]。由NFTs引起的神经元纤维退化在AD发病中起重要作用,与其临床痴呆症状呈平行关系。
Tau蛋白至少存在数十个Ser或Thr磷酸化位点。胎脑中Ser396位点有磷酸化形成,在成年人脑中该位点不再有磷酸化形成;而在AD患者脑中,Ser396位点上则可发生磷酸化。故笔者选用Ser396位点研究tau蛋白磷酸化情况,同时检测Tau-5表达,借此观察石菖蒲-远志药对不同组分对其磷酸化程度的影响。
本研究显示,与正常对照组比较,不同剂量的石菖蒲-远志药对不同组分对Tau-5表达的影响差异无统计学意义;对Ser396 位点磷酸化的检测发现,与模型对照组比较,石菖蒲-远志小、中、大剂量组Ser396磷酸化水平下降,且水提物治疗组效果略优于挥发油治疗组。Tau-5无明显变化,可能与Tau蛋白磷酸化后其降解减少有关,但也有可能与tau蛋白功能异常后,细胞代偿合成增加有关。实验证实,石菖蒲-远志药对两种组分均能减轻D-半乳糖诱导的大鼠海马神经元tau 蛋白在Ser396位点的过度磷酸化程度,从而抑制或减缓AD模型大鼠的病理改变,提示两药配伍能对AD模型大鼠神经细胞中磷酸化Tau蛋白Ser396位点有显著的去磷酸化作用,提示其对AD有一定的治疗作用。
The authors have declared that no competing interests exist.
