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医药导报
医药导报, 2016, 35(增刊): 103-105
doi: 10.3870/j.issn.1004-0781.2016.z1.047
呋喃二烯纳米脂质载体中主药含量及包封率的测定
冯枫1,, 孙林林2, 王聚2, 王艳群2, 吴影琪2, 张建梅2, 张欢2, 王东凯2,
1. 广西食品药品检验所中药室,南宁 530021
2.沈阳药科大学药学院,沈阳 110016

作者简介 冯枫(1972-),男,辽宁人,主管药师,学士,主要研究方向:中药质量标准与中药新药开发。E-mail:fengf@yeah.net。

通信作者 王东凯(1962-),男,辽宁沈阳人, 教授,博士生导师,博士,主要从事药物制剂新剂型及新技术研究。电话:024-23986310, E-mail:wangdksy@126.com。
中图分类号: R979.1     文献标识码: B     文章编号: 1004-0781(2016)08增-0103-03
摘要:

目的 建立呋喃二烯纳米脂质载体(FN-NLC)包封率和含量测定方法。方法 采用微柱离心法分离FN-NLC中游离药物,高效液相色谱法测定药物浓度并计算包封率。结果 微柱离心法可以很好地将纳米脂质载体与游离药物分离,空白纳米脂质载体的回收率为98.6%~100.3%,游离药物的吸附率高于99%;纳米脂质载体的包封率约90%。结论 葡聚糖凝胶微柱离心法快速便捷,准确性高,适于FN-NLC含量和包封率的测定。
关键词: 呋喃二烯 ; 纳米脂质载体 ; 包封率 ; 葡聚糖凝胶微柱离心法

Abstract:

呋喃二烯(furanodiene,FN)是从传统抗癌中药温莪术油中提取到的一个强亲脂性含氧倍半萜类化合物[1-2],占温莪术油的20%~30%,是其主成分。药理研究表明[3],FN抑肿瘤活性显著,具有广谱、低毒、高选择性抗癌作用,在体外,FN对宫颈癌、喉癌Hep-2、前列腺癌PC3、胃癌SGC-7901等细胞有较强的抑制作用,在体内对宫颈癌U14、小鼠肉瘤S180和脑胶质瘤的生长有抑制效果[4-5]。但FN在水中难溶,半衰期短[1],大大降低了其药效活性。为延长呋喃二烯在血液中的滞留时间,提高血液中药物浓度,使药物更多的到达病灶部位,提高治疗效果,笔者采用乳化超声法制备了呋喃二烯纳米脂质载体,并建立FN-NLC中呋喃二烯包封率和含量测定方法,更好地进行制剂质量控制。

1 仪器与试药
1.1 仪器

BS110S型精密电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司),PF-101T 集热式恒温磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂),JY-92Ⅱ超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所),KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),80-2型离心机(上海君竺仪器制造有限公司),LC-10A高效液相色谱仪(LC-10AT泵、SIL-10AF自动进样器、SPD-10A检测器、LCsolution色谱工作站,日本岛津公司), Zetasizer Nano ZS 90粒度测定仪(英国马尔文公司),透射电子显微镜(Tecnai G220,美国FEI公司)。

1.2 试剂

呋喃二烯(海南碧凯药业有限公司),注射用大豆磷脂(PC,上海太伟药业有限公司),中链甘油三酸酯(MCT,铁岭北亚药用油有限公司),单硬脂酸甘油酯(GMS,天津市博迪化工股份有限公司),脱氧胆酸钠(北京双旋微生物培养基制品厂),泊洛沙姆188(F68,德国BASF公司),SephadexG-50葡聚糖凝胶(北京瑞达恒辉科技发展有限公司),甲醇(色谱纯,天津市康科德科技有限公司),其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果
2.1 含量测定方法学

2.1.1 色谱条件 色谱柱:ODS-2 HYPERSIL柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相:甲醇-水(90:10);流速:1.0 mL·min-1;检测波长:216 nm;进样量:20 μL;柱温:25 ℃。

2.1.2 专属性实验 取呋喃二烯适量,加甲醇溶解并稀释成约20 μg·mL-1溶液,按“2.1.1”项色谱条件进行测定;另精密移取适量空白和载药纳米粒,加甲醇稀释至一定浓度溶液,同法测定。结果见图1, 呋喃二烯峰形良好、空白辅料无干扰,表明该色谱条件专属性好。


图1 呋喃二烯对照品溶液 (A)、空白NLC (B)和FN-NLC (C)的HPLC图

2.1.3 线性关系考察 准确配制浓度为100 μg·mL-1对照品储备液。分别精密移取上述储备液适量,用甲醇配制成浓度为0.05,0.5,5.0,10.0,20.0,40.0,60.0 μg·mL-1呋喃二烯对照品溶液,按“2.1.1”项色谱条件测定,以峰面积Y对浓度X进行线性回归,得线性方程Y=56 781X+3 092.8( r=0.999 8),表明呋喃二烯溶液在质量浓度0.05~60.0 μg·mL-1范围内线性关系良好,见图2。


图2 呋喃二烯线性回归曲线

2.1.4 精密度实验 配制10.0,20.0,30.0 μg·mL-1对照品溶液,每个浓度溶液进行5样本分析,分别于一天内重复测定5次及连续测定5 d,根据标准曲线方程,计算检出量,求算日内、日间相对标准偏差,结果见表1。由结果可知,日内和日间精密度的RSD均<2%,符合方法学要求。

表1 精密度测定结果
加入量/
(μg·mL-1)		 日内 日间
平均/
(μg·mL-1)		 RSD/
%		 平均/
(μg·mL-1)		 RSD/
%
10.0 11.48 0.49 11.50 0.85
20.0 21.40 0.75 21.45 0.48
30.0 32.38 0.60 32.12 0.97

表1 精密度测定结果

2.1.5 回收率实验 于空白纳米脂质载体中分别精密加入50%,100%,150% FN溶液,每个浓度3份,加入甲醇破乳后用流动相稀释至刻度,摇匀,经孔径0.45 μm微孔滤膜滤过,各取续滤液20 μL注入高效液相色谱仪,根据测得量和加入量的比值计算回收率。结果见表2,表明回收率符合方法学要求。

表2 回收率测定结果
序号 加入量/
(μg·mL-1)		 测得量/
(μg·mL-1)		 回收率/
%		 平均回收率/
%		 RSD/
%
1 10.58 10.69 101.0
2 10.83 10.89 100.6 100.3 0.87
3 10.56 10.49 99.3
4 20.51 20.53 100.1
5 20.56 20.54 99.9 100.0 0.10
6 20.62 20.62 100.0
7 32.01 32.28 100.8
8 32.16 32.14 99.9 100.3 0.50
9 32.22 32.22 100.2

表2 回收率测定结果

2.1.6 定量限 取呋喃二烯储备液,稀释适当倍数,当稀释到FN 0.05 μg·mL-1时,由色谱图1可知,信噪比为10(S/N=10)。因此,在该色谱条件下,FN的定量限为1 ng。

2.2 呋喃二烯纳米脂质载体的制备

采用乳化超声法制备FN-NLC[6]。称取处方量的主药、单硬脂酸甘油酯、中链三酰甘油加热熔融形成油相。另称取处方量的泊洛沙姆188、豆磷脂、脱氧胆酸钠溶于蒸馏水形成水相。保持水相和油相相同的温度,在搅拌的条件下将水相滴加到油相中制成初乳, 最后将初乳通过超声细胞粉碎机超声, 微孔滤膜过滤,冰水浴冷却即得FN-NLC。同法制得不加FN的空白NLC混悬液。扫描电镜及粒径结果如图3。透射电镜下多为类球型实体粒子,粒度测定仪测得粒子平均粒径为89.8 nm。


图3 呋喃二纳米脂质载体透射电镜和粒径图

2.3 药物含量和包封率的测定

2.3.1 微柱离心法测定包封率

2.3.1.1 微型凝胶柱的制备 将葡聚糖凝胶G-50 在纯化水中浸泡24 h,充分溶胀,装入2.5 mL注射器(底部填入双层滤纸片以防胶漏)。待水分自然流下后将该注射器置离心机中, 2 000 r·min-1离心3 min,备用[7]。

2.3.1.2 微型凝胶柱对空白纳米脂质载体的吸附 采用浊度法考察葡聚糖凝胶柱对空白纳米粒的吸附情况。取空白纳米粒0.1 mL,用重蒸水稀释至10 mL,于420 nm波长处测定吸光度(记为Abefore);另取空白纳米粒0.1 mL加于制备好的葡聚糖凝胶微柱顶端,2 000 r·min-1离心3 min,连续操作3次,收集洗脱液,用重蒸水稀释至10 mL,于420 nm处测定吸光度(记为Aafter)。按Aafter /Abefore×100%计算回收率,并按上述步骤考察微型凝胶柱对低、中、高(0.05,0.1,0.2 mL)不同量空白纳米粒的洗脱能力,回收率计算结果见表3。

表3 微型凝胶柱吸附空白纳米脂质载体的回收率
NLC/mL Abefore Aafter 回收率/% RSD/%
0.05 0.164 0.161 98.6 0.71
0.1 0.324 0.325 100.2 0.77
0.2 0.644 0.646 100.3 0.47

表3 微型凝胶柱吸附空白纳米脂质载体的回收率

由表3知,经3次洗脱空白脂质体的回收率高达99.67%,即葡聚糖凝胶微柱对空白纳米脂质载体无吸附,同时确定洗脱次数为3次。

2.3.1.3 微型凝胶柱对呋喃二烯溶液的吸附 分别配制浓度为1.0,2.0,3.0 mg·mL-1FN溶液,取上述溶液0.1 mL各2份。一份用破乳剂稀释至10 mL,摇匀,于216 nm处测定并计算药物浓度(记为Cbefore)。另一份加于制备好的葡聚糖凝胶微柱顶端,然后自顶端加入重蒸水0.5 mL,2 000 r·min-1离心3 min洗脱,重复洗脱3次,收集洗脱液于10 mL量瓶中,加甲醇稀释定容,摇匀在216 nm处测定并计算药物浓度(记为Cafter),吸附率根据公式A=(1-Cafter /Cbefore)×100%计算,结果见表4。结果表明,葡聚糖凝胶微柱几乎可以完全吸附0.1mL浓度1.0~3.0 mg·mL-1的FN溶液。

表4 微型凝胶柱对呋喃二烯溶液的吸附
Cbefore /(μg·mL-1) Cafter /(μg·mL-1) 回收率/% 吸附率/%
10.015 0.002 0.02 99.98
20.128 0.005 0.04 99.96
30.085 0.013 0.04 99.96

表4 微型凝胶柱对呋喃二烯溶液的吸附

2.3.1.4 呋喃二烯纳米脂质载体包封率及含量的测定 取FN-NLC 0.1 mL两份,其中取一份于10 mL量瓶中,加入重蒸水1.5 mL,甲醇稀释定容后,用0.22 μm微孔滤膜过滤,取续滤液20 μL,注入液相色谱仪,测定总药浓度(C0)。另一份加于葡聚糖凝胶微柱顶端,2 000 r·min-1离心3 min,然后自顶端加入重蒸水0.5 mL,2 000 r·min-1离心3 min,重复洗脱3次,合并洗脱液于10 mL量瓶中,加甲醇稀释定容后同法操作,测定FN-NLC包封药物浓度C1。包封率(%)=C1/C0×100 %。制备3批FN-NLC,测定其平均包封率和药物含量,结果见表5。

表5 3批FN-NLC含量及包封率
NO. 1 2 3 平 均
C/(mg·mL-1) 1.98 2.07 2.09 2.05 ± 0.06
EE/% 89.87 91.52 92.42 91.27 ± 1.29

表5 3批FN-NLC含量及包封率

3 讨论

笔者在本实验中采用乳化超声法制备FN-NLC,可得到分布均匀且粒径较小的粒子。NLC包封率测定方法有很多种[8-10],如葡聚糖凝胶柱法、离子交换树脂法、微型柱法、超速离心法、超滤法及透析法等,通常是采用一定的方法使纳米粒和外水相游离药物分离,然后测定分离后的任何一部分均可,计算包封率。

笔者采用超速离心法于50 000 r·min-1条件下离心2 h仍未能将纳米粒中油水两相分离,表明此法不适用于该制剂包封率的测定。透析法所需时间较长,且透析过程有可能破坏纳米粒和游离药物的动态平衡,导致包封在纳米粒中的药物渗漏,测定值比实际值小。超滤法受仪器设备限制且长时间使用后超滤膜易被污染,导致测量结果不准确,效率降低。微柱离心法结合了离心法和葡聚糖柱层析法的优点,既可以有效的分离纳米粒和游离药物,又可以加快纳米粒的洗脱速度,缩短洗脱时间,且可减小纳米粒溶液稀释倍数及样品用量。

The authors have declared that no competing interests exist.
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呋喃二烯
纳米脂质载体
包封率
葡聚糖凝胶微柱离心法
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冯枫
孙林林
王聚
王艳群
吴影琪
张建梅
张欢
王东凯