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美国《化学文摘》《国际药学文摘》
《乌利希期刊指南》
WHO《西太平洋地区医学索引》来源期刊
日本科学技术振兴机构数据库（JST）
第七届湖北十大名刊提名奖
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, 顾红梅
目的 建立恩替卡韦分散片微生物限度检查法,并进行方法学验证。方法 按《中华人民共和国药典》规定,采用常规法、培养液稀释法对5种对照菌进行回收率测定实验,建立恩替卡韦分散片微生物限度检查法,并对其进行方法学验证。结果 采用常规法,恩替卡韦分散片对白念珠菌、黑曲霉菌、枯草芽孢菌的菌落回收率均>70.0%,但对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌回收率<70.0%;采用培养液稀释法,恩替卡韦分散片对枯草芽孢菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的菌落回收率均>80.0%,且控制菌能正常检出。结论 恩替卡韦分散片细菌数及控制菌的检定可采用培养液稀释法测定;真菌及酵母菌的检定可采用常规法测定。
恩替卡韦是一种强有效的、选择性的口服抗乙肝病毒药物,于2005年被美国食品药品管理局(FDA)批准用于慢性乙型肝炎的治疗[1],其疗效突出,目前已成为治疗慢性乙型肝炎的一线药物。由于恩替卡韦可溶性差,临床多采用片剂、口服液和分散片等剂型[2]。其中,恩替卡韦分散片可有效改善其溶解性,具有崩解时间短、吸收快、生物利用度高等优势[3],且价格较其他剂型便宜,更易被患者接受,已广泛应用于临床[4]。药物微生物限度检查是保证安全用药的重要指标之一。2010年版《中华人民共和国药典》规定,在建立一种药品微生物限度检查方法时,应对所用方法进行验证,以确保方法能准确有效地检出药品中微生物,防止药物有抑菌作用[5]。笔者查阅相关文献,未见报道恩替卡韦药物微生物限度检查法,为加强药物各个环节安全性,本实验采用常规法和培养液稀释法对恩替卡韦分散片的微生物限度检查方法进行验证,以期为临床安全使用恩替卡韦分散片奠定基础。
台式高速冷冻离心机-H1850R(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);DK-S12型电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司);HTY反复使用集菌器(杭州市泰林生物技术设备有限公司);HTY-302微生物限度检测仪(杭州市泰林生物技术设备有限公司)。
恩替卡韦分散片(正大天晴药业股份有限公司产品,批号:070125,070126,070127);pH值=7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液;0.9%无菌氯化钠溶液。
营养肉汤培养液(批号:050920);改良马丁培养液(批号:051118);营养琼脂培养液(批号:060111);玫瑰红钠琼脂培养液(批号:060306);胆盐乳糖培养液(批号:060228);MUG培养液(批号:060117)均购于北京三药科技开发公司。
大肠埃希菌[CMCC(B) 44102],金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26003],枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63501],白念珠菌[CMCC(B) 98001],黑曲霉菌[CMCC(B) 44102] 均由中国食品药品检定研究院提供。
取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的新鲜培养物分别接种在营养肉汤培养液10 mL中,于35 ℃下培养24 h后,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-7,使菌液含菌量为50~100 cfu·mL-1,备用。
取白念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂培养液10 mL上,于25 ℃下培养48 h后,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-7,使菌液含菌量为50~100 cfu·mL-1,备用。
取黑曲霉菌的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂培养液10 mL上,于25 ℃培养6 d后,形成大量孢子,用0.9%无菌氯化钠溶液洗脱孢子,滤过,稀释至含孢子数为50~100 cfu·mL-1的混悬液,备用。
取恩替卡韦分散片10.0 g,加pH值=7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL,45 ℃水浴下加热使其溶解,混匀,即得1:10的供试品溶液,备用。
2.3.1 实验组 常规法:取供试品溶液1 mL和50~100 cfu·mL-1试验菌各1 mL,分别注入同一平皿中,立即倾注琼脂培养液(细菌注入营养琼脂培养液,真菌和酵母菌注入玫瑰红钠琼脂培养液),每株试验菌平行制备2个平皿,按平皿法测定其菌落数。
培养液稀释法:取供试品溶液1 mL,分别注入5个平皿内,制成每皿0.2 mL;分别注入50~100 cfu·mL-1实验菌1 mL后,立即倾注营养琼脂培养液,每株实验菌平行制备2次,按平皿法测定其菌数。
2.3.2 菌液组 用稀释剂0.9%无菌氯化钠溶液代替供试品溶液,加入实验菌,同试验组操作。
2.3.3 供试品对照组 取制备好的供试品溶液,以稀释剂0.9%无菌氯化钠溶液代替实验菌,同试验组操作。
2.3.4 结果判断 实验组菌回收率(%)=(实验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数×100%。
采用常规法对各菌菌落数测定,结果见
表1 常规法测定恩替卡韦分散片各菌种的回收率
根据供试品须符合的微生物限定标准和菌数报告规则,在不影响检查判断的情况下,可采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验,故又采用培养液稀释法对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌再次进行验证,结果见
表2 培养液稀释法测定恩替卡韦分散片细菌的回收率
由
2.5.1 实验组 实验组:取供试品溶液10 mL接种至胆盐乳糖培养液200 mL内,加入50~100 cfu·mL-1大肠埃希菌1 mL,于36 ℃下培养24 h。取上述培养液0.2 mL接种至MUG培养液5 mL试管内,培养24 h,置365 nm紫外灯下观察有无荧光反应,然后滴加靛基质试液,观察颜色变化。
另取供试品溶液10 mL接种至500 mL胆盐乳糖培养液内,加入10~100 cfu·mL-1大肠埃希菌1 mL,于36 ℃下培养48 h,取上述培养液0.2 mL接种至MUG培养液5 mL试管内,培养24 h,置365 nm紫外灯下观察有无荧光反应,然后滴加靛基质试液,观察颜色变化。
2.5.2 阴性对照组 取金黄色葡萄球菌作为阴性对照实验菌,方法同实验组。
2.5.3 验证结果 采用常规法对控制菌进行检查验证时,实验组和阴性对照组均未检出实验菌,说明胆盐乳糖培养液200 mL不可以消除恩替卡韦分散片对大肠埃希菌的抑菌作用。采用培养液稀释法对其进行再次检查验证,实验组检出控制菌,阴性对照组未检出控制菌(结果见
表3 控制菌检查方法验证结果
笔者在本实验对恩替卡韦分散片的微生物限度检查方法进行了验证,采用常规法对5种对照菌菌落回收率进行测定,结果发现恩替卡韦分散片对真菌类无抑菌作用,此方法可用于霉菌和酵母菌的检查,但对细菌有一定的抑制作用,需重新建立细菌检定方法;进一步采用培养液稀释法,对实验细菌进行测定,菌落回收率均高于80.0%,说明培养液稀释法可排除药物抑菌作用的干扰,可用于恩替卡韦分散片细菌的检定,并对控制菌大肠埃希菌进行了验证,此法可行。
The authors have declared that no competing interests exist.
