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美国《化学文摘》《国际药学文摘》
《乌利希期刊指南》
WHO《西太平洋地区医学索引》来源期刊
日本科学技术振兴机构数据库（JST）
第七届湖北十大名刊提名奖
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, 杨同华, 刘阳
目的 研究肉桂中桂皮醛对白血病K562细胞株生物学特性的影响。方法 噻唑蓝(MTT)法检测桂皮醛作用K562细胞72 h的无细胞毒的浓度范围。肉桂中的有效成分桂皮醛经提取后作用K562细胞,电子显微镜下观察白血病细胞形态变化。流式细胞仪检测白血病细胞的细胞周期状态、凋亡的情况。结果 50~75 μg·mL-1桂皮醛对K562细胞增殖有明显的抑制作用,并呈剂量和时间依赖性(
肉桂(cinnamomum cassia,CC) 为樟科植物肉桂的干燥树皮,桂皮醛是其挥发油中的主要成分。桂皮醛具抗肿瘤活性,其机制主要包括对肿瘤细胞的细胞毒作用和诱导肿瘤细胞产生凋亡[1-2]。在PLC/PRF/5细胞中,桂皮醛诱导MAPK丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)抑制剂SP600125、PD98059、SB203580影响MAPK通路,桂皮醛诱导肿瘤细胞凋亡可能通过促Bcl-2家族[3]来实现。现今生物医学领域内最热门的课题之一便是白血病细胞的诱导分化及逆转机制研究[4-5]。白血病已经被公认为是严重危害人类生命健康的造血系统恶性肿瘤,其生物学特征是造血细胞增殖失控,使细胞不能分化成熟,细胞的正常凋亡过程障碍,而出现异常分化细胞大量增殖。笔者采用肉桂提取物桂皮醛作用于研究的白血病K562细胞株,监测K562细胞所处不同细胞周期的比例、细胞凋亡的改变。
K562细胞从中国科学院昆明动物研究所购买。
RPMI1640培养液,GIBCO公司,批号:31800-022。胎牛血清,杭州四季青公司,批号:20120904。阳性对照药顺铂,Sigma公司,批号:20120712。肉桂购买于昆明菊花村中药材市场,经过中国科学院植物研究所中药与天然药物化学成分与生物学功能研究实验室程永现研究员进行鉴定,采用薄层层析法鉴定出含肉桂>99%。桂皮醛从肉桂中提取,桂皮醛含量为11.82 mg·g-1[6]。
Diamonsil C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm)。e2695高效液相色谱仪,Waters公司。FACSArial Ⅱ流式细胞仪,美国BD公司。MCO-15AC二氧化碳恒温培养箱,日本三洋公司。SW-CJ-1FD单人单面净化工作台。Anthos 2010全自动定量酶标仪,奥地利Anthos仪器公司。JSM-7500F扫描电子显微镜,日本电子株式会社。
肉桂皮切成长度<2 cm的小段,取肉桂皮100 g加到1 000 mL的圆底烧瓶中,加入70%乙醇500 mL浸泡24 h,抽滤,上清液保存。继续将70%乙醇500 mL浸泡肉桂滤渣24 h,共重复3次。将上清液收集,用旋转蒸发仪进行浓缩,直至得到黏稠的固体,称定质量[7]。
将白血病K562细胞接种于含10%小牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1链霉素的RPMI-1640培养液中,在37 ℃ 含5%CO2的培养箱内培养传代。每2~3 d换液1次,所有实验均在细胞的对数生长期内进行。
将稀释制备好的K562细胞悬液以1.0×105·mL-1密度接种于96 孔板,每孔180 μL,培养过夜,静置,分别加入6组不同浓度桂皮醛的药物培养液5,10,25,50,75,100 μg·mL-1到K562细胞中,并设置对照组。药物作用24,48,72 h后培养结束前4 h加入MTT,继续培养4 h后倾去培养液,加入二甲亚砜(DMSO)100 μL使溶解、显色,用酶联仪以490 nm波长测定,以桂皮醛浓度(μg·mL-1)为横坐标,细胞死亡率(%)为纵坐标,以吸光度(
收集对数生长期的细胞,调整细胞浓度为1×105个·mL-1,用桂皮醛终浓度依次为50,75 μg·mL-1作用K562细胞72 h。同时设立对照组。分别收集细胞。实验重复3次。50,75 μg·mL-1的顺铂为阳性对照。
将桂皮醛诱导72 h的K562细胞及阴性对照组细胞制成单细胞悬液,1 300 r·min-1离心5 min,弃去培养液,用4 ℃预冷的PBS洗1次,离心弃去PBS,加入PBS100~150 μL制成单细胞悬液,吸取细胞悬液迅速吹入70%预冷的乙醇中振荡混匀,4 ℃冰箱固定过夜。离心弃去固定液,用磷酸盐缓冲溶液(PBS) 1 mL重悬,离心,弃去上清液,加PBS 1 mL,吹打均匀,过300目筛网。细胞计数。将细胞调成106个·mL-1单细胞悬液。离心细胞,弃去上清液。加入Rnase A酶(工作浓度20 μg·mL-1),体积为500 μL,溶于PBS中,室温避光孵育30 min。提前准备好冰水混合物,将避光孵育的细胞悬液放入其中冰浴1~2 min。终止酶的作用。离心,除去上清液。加入碘化丙啶(PI,工作浓度50 μg·mL-1),体积为500 μL,酶溶于PBS中,室温避光孵育30 min后上机检测。实验重复3次。相同浓度的顺铂为阳性对照。
将桂皮醛诱导72 h及阴性对照组K562细胞离心后,制成单细胞悬液,用PBS洗2次,收集(1~5)×105个细胞。在细胞中加入500 μL的Binding buffer混匀。其中样本管和阴性管均加。样本管加入Annexin Ⅴ-FITC 5 μL混匀后,加入Propidium Iodide 5 μL混匀。室温避光反应5~15 min。在1 h内,进行流式细胞仪的检测。实验重复3次。相同浓度的顺铂为阳性对照。
采用SPSS 16.0版软件进行统计分析, 数据以均数±标准差(
桂皮醛对K562细胞体外增殖有明显的抑制作用,随作用时间延长,相同浓度桂皮醛对K562细胞增殖抑制作用增强。桂皮醛抑制K562细胞具有时间依赖性。桂皮醛对K562细胞随浓度的增高,抑制作用增强。各浓度桂皮醛作用K562细胞24 h,抑制效果不明显。50,75 μg·mL-1的桂皮醛作用K562细胞,抑制效果明显,又没有细胞毒作用。见
表1
MTT法测定不同浓度桂皮醛在不同时间对K562细胞增殖的抑制%,
2.2.1 光学显微镜观察 Wright-Gimesa染色,正常对照组K562细胞体积较大,平均直径为25 μm,形态多呈圆形或略欠规则的圆形;细胞核呈圆形或椭圆形,染色质疏松呈紫红色,核仁清晰,每个细胞有2~4个,核质比大,细胞质为深蓝色,边缘可见伪足样突起,胞质中无颗粒,偶见细胞质内有空泡,MPO染色呈阴性反应,为原始未分化状态细胞(
2.2.2 电子显微镜观察 对照组未经处理的K562细胞核膜完整,核仁明显,细胞形态正常,胞质电子密度较低。桂皮醛组K562细胞72 h后可见明显的凋亡形态学改变。电镜下可见细胞核固缩,染色质凝集成新月形紧贴于核膜周围,核膜扭曲,细胞质空泡化,胞质电子密度增高等特征,见
细胞周期检测结果见
表2
3组K562细胞的细胞周期分布%,
结果显示桂皮醛和顺铂作用K562细胞72 h后,K562细胞72 h凋亡率是(0.112±0.017)%;50,75 μg·mL-1桂皮醛72 h凋亡率分别是(1.979±0.057)%,(5.690±0.182)%;50,75 μg·mL-1顺铂72 h凋亡率分别是(1.963±0.147)%,(4.396±0.223)%。随着浓度的增加,凋亡细胞的比例也逐渐增加。与对照组比较,差异有统计学意义(
白血病是一种恶性肿瘤,关于白血病的治疗由于骨髓移植配型的限制,大多以化疗为主。然而,化疗药物的不良反应,使患者的生存质量极大地降低。因此,寻找低毒高效的新药用于控制白血病已经成为亟待解决的问题[8]。
目前,从天然资源的中药筛选抗肿瘤药物已变成肿瘤药物治疗研究的一个热点,有很多中药单体如紫杉醇、喜树碱、鸦胆子等已被应用于临床[9]。已有研究发现人参多碱、当归多糖、昆明山海棠总生物碱等中药的提取物具有抑制K562细胞增殖、诱导其分化凋亡、抗耐药、提高机体免疫力和造血功能的作用,能缓解放化疗引起的一系列不良反应[10]。目前关于作为传统中药肉桂挥发油中的主要成分的肉桂醛被证实具有良好体内体外抗肿瘤作用,其对体外培养的人皮肤黑色素瘤(A375)、乳腺癌( SKBr-2HL)、食管癌( Eca-109)、肾癌( GRC-1)细胞的增殖具有良好的抑制作用,在适当剂量范围内能够保护和恢复荷瘤小鼠的免疫功能[11]。又有研究发现,桂皮醛通过干预高糖条件下DRGn 24 h可显著提高DRGn细胞活性,降低了DRGn细胞的凋亡,机制是桂皮醛主要通过抑制NF-KB通路发挥作用,桂皮醛可以实现对细胞凋亡的影响[12]。
细胞凋亡是由基因控制的细胞自主有序的死亡,肿瘤无限制增生的恶性生物学特征与肿瘤细胞凋亡减少有关[13]。研究人员发现3种柑橘类香精油(柠檬油、柚子油和甜橙油)均能明显诱导 HL-60 细胞凋亡,结果提示含有醛类的组分具有更高的诱导凋亡活性,且该香精油中的柠檬醛、香茅醛以及葵醛是主要的活性物质,它们均具有醛基[14]。在对桂皮醛诱导细胞凋亡的机制上来看,有研究发现桂皮醛可体外抑制BCR-ABL基因表达及 BCR-ABL蛋白的酪氨酸激酶活性 ,发挥抗白血病效应[15]。以上研究均表明醛类与诱导细胞凋亡具有一定的相关性。
本实验中,笔者以K562细胞株作为研究对象,选用肉桂分离纯化,制备供试样品桂皮醛,采用流式细胞术凋亡测试得出桂皮醛可能部分通过诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖。流式细胞术检测桂皮醛对K562细胞周期变化的影响,S期比桂皮醛可能是使更多细胞通过S期限制点对细胞周期进行调节,从而进一步抑制细胞增殖的。迄今为止,人们对桂皮醛抗肿瘤的作用机理的研究很少,本实验研究显示,桂皮醛使K562的细胞周期S期比例上升,提示细胞增殖,周期和凋亡有显著影响,希望能对桂皮醛在临床治疗肿瘤的应用提供理论基础。
The authors have declared that no competing interests exist.
