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美国《化学文摘》《国际药学文摘》
《乌利希期刊指南》
WHO《西太平洋地区医学索引》来源期刊
日本科学技术振兴机构数据库（JST）
第七届湖北十大名刊提名奖
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第七届湖北十大名刊提名奖
, 冉京燕, 王文清
, RAN Jingyan, WANG Wenqing,
目的 高效液相色谱法检测赖氨葡锌口服溶液中的有关物质。方法 采用自身稀释对照法对赖氨葡锌口服溶液中的有关物质进行检测,色谱柱为Inertsil Amide (4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相A为磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾2.72 g和辛烷磺酸钠0.46 g,加水1 000 mL使溶解)-乙腈(22:78),B为磷酸盐缓冲液-乙腈(95:5),梯度洗脱,流速1.0 mL·min-1,柱温为30 ℃,检测波长为203 nm。结果 葡萄糖酸锌和盐酸赖氨酸与相邻杂质峰分离度均大于2.0,各峰理论板数均大于3 000;空白辅料及其破坏实验产物不干扰测定。结论 该方法可同时检测盐酸赖氨酸和葡萄糖酸锌的有关物质,简单易行,专属性强、耐用性好,可用于赖氨葡锌口服溶液中有关物质的检测。
Objective To establish a HPLC method for the determination of related substances in lysine hydrochloride and zinc gluconate oral solution. Methods The HPLC separation was performed at 30 ℃ on an Inertsil Amide column (4.6 mm×250 mm,5 μm) by gradient elution with mobile phase A [phosphatesolution (2.72 g KH2PO4 and 0.46 goctane sulfonate,added with 1 000 mL)-acetonitrile (22:78)] and B [phosphate solution-acetonitrile (95:5)] at the flow rate of 1.0 mL·min-1.The clumn temperature was 30 ℃.The determination wavelength was 203 nm. Results The major peaks were well separated from adjacent related substances peaks and resolution were greater than 2.0.The theoretical plate number of major peaks and related substance peaks were greater than 3 000.Excipients and destruction test products did not interfere with the determination. Conclusion This method is practicable,specific and durable for the simultaneous determination of related substances in lysine hydrochloride and zinc gluconate oral solution.
赖氨酸是人体8种必须氨基酸之一,在人体的发育、免疫系统的增强以及机体代谢过程中发挥重要的作用,若缺乏可导致发育迟缓、贫血、疲劳等症[1]。锌是一种人体必需的微量元素,对人体尤其是儿童的生长发育、免疫调节及内分泌调节意义重大,在治疗感冒[2]和改善味觉[3]方面也有一定作用。赖氨葡锌口服溶液是以赖氨葡锌片为原型药物,由片剂改成的口服溶液剂,主要用于防治小儿及青少年因缺乏赖氨酸和锌而引起的生长发育迟缓、营养不良及食欲缺乏等症状。《中华人民共和国药典》2010年版[4]和2015年版[5]均收载了盐酸赖氨酸和葡萄糖酸锌原料药的质量标准,采用薄层色谱法控制盐酸赖氨酸的有关物质,但对葡萄糖酸锌的有关物质未做规定,笔者也未见有药典或文献等报道葡萄糖酸锌有关物质检查方法。笔者首次对葡萄糖酸锌的有关物质进行分析,并建立了可同时检查盐酸赖氨酸和葡萄糖酸锌有关物质的高效液相色谱法,为相关制剂的质量控制提供参考。
LC-20AD型高效液相色谱仪(日本岛津公司),包括LC-20AD泵,SPD-M20A型二极管阵列检测器(190~800 nm),SIL-20A型自动进样器,LC-solution工作站;Inertsil Amide色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)(日本岛津公司);AUW 220D型双量程分析天平(日本岛津公司,感量为0.1 mg/0.01 mg)。
葡萄糖酸锌对照品(中国食品药品检定研究院,批号:100332-201102);盐酸赖氨酸对照品(中国食品药品检定研究院,批号:140673-201408);葡萄糖酸内酯(购自国药集团化学试剂有限公司,批号:20141203);赖氨葡锌口服溶液(武汉金联药业有限公司,批号: 20151001,20151002,20151003,20151004,每100 mL含盐酸赖氨酸0.4 g,葡萄糖酸锌0.35 g)。乙腈(购自美国天地公司,色谱纯),其他试剂为分析纯,水为新制多效双蒸水。
2.1.1 对照品溶液的制备 取葡萄糖酸锌对照品和盐酸赖氨酸对照品各约20 mg,置同一10 mL量瓶中,用水溶解并定容至刻度,摇匀,经孔径0.45 μm滤膜滤过,即得。
2.1.2 供试品溶液 取赖氨葡锌口服溶液适量,经孔径0.45 μm滤膜滤过,即得。
2.1.3 对照溶液 精密量取赖氨葡锌口服溶液1 mL,置100 mL量瓶,加水稀释至刻度,摇匀,经孔径0.45 μm滤膜滤过,即得。
2.1.4 空白对照溶液 取辅料适量制备不含葡萄糖酸锌和盐酸赖氨酸的空白溶液,按供试品溶液的制备方法制备空白对照溶液。
2.1.5 系统适用性实验溶液 取葡萄糖酸内酯10 mg,置10 mL量瓶,加赖氨葡锌口服溶液溶解并稀释制至刻度,摇匀,经孔径0.45 μm滤膜滤过,即得。
2.1.6 葡萄糖酸锌溶液 取葡萄糖酸锌原料0.35 g,置100 mL量瓶,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
取系统适用性实验溶液10 μL进样,按下述色谱条件进行实验,记录色谱图。色谱柱为Inertsil Amide (4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相A为磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾2.72 g和辛烷磺酸钠0.46 g,加水1 000 mL使溶解)-乙腈(22:78),B为磷酸盐缓冲液-乙腈(95:5),按下表进行梯度洗脱;流速为1 mL·min-1;柱温为30 ℃;检测波长为203 nm。结果系统适用性实验图谱(
表1 梯度洗脱程序
Tab.1 Program of gradient elution
2.3.1 空白干扰实验 取对照品溶液、供试品溶液、对照溶液和空白对照溶液各15 μL,分别注入液相色谱仪,照上述色谱条件实验,记录色谱图。结果供试品溶液和对照溶液在与对照品溶液保留时间相同的位置有色谱峰,且空白对照溶液在相同保留时间处无干扰峰,表明本法专属性好。见
图1
专属性考察
a.系统适用性实验溶液;b.供试品溶液;c.空白溶液;d.葡萄糖酸锌溶液;e.盐酸赖氨酸溶液;f.葡萄糖酸内酯溶液;1.辅料;2.盐酸;3.葡萄糖酸内酯;4.葡萄糖酸锌;5.赖氨酸
Fig.1
Result of specificity test
a.system suitability solution;b. sample solution;c.blank solution;d.zinc gluconate solution;e.lysine hydrochloride solution;f.gluconic acid lactone solution;1. excipient;2. hydrochloride;3. gluconic acid lactone;4. zinc gluconate;5. lysine
2.3.2 破坏实验 精密量取葡萄糖酸锌溶液8 mL,置10 mL量瓶,共5份,其中3份分别加10%的磷酸溶液0.2 mL、饱和氢氧化钠溶液0.5 mL、30%双氧水1.5 mL,摇匀,室温下放置12 h;另外2份分别置110 ℃恒温烘箱和4 500 Lx强光下破坏12 h,再加水定容至刻度,摇匀,得酸破坏、碱破坏、氧化破坏、高温破坏和光照破坏样品。另取葡萄糖酸锌溶液8 mL,置10 mL量瓶,加水定容至刻度,摇匀,即得葡萄糖酸锌的参比对照溶液。分别取葡萄糖酸锌参比对照溶液及其破坏样品溶液各10 μL注入液相色谱仪,按“2.2”项下色谱条件实验,记录色谱图。同法对盐酸赖氨酸溶液、赖氨葡锌口服溶液和空白溶液进行破坏实验,并记录色谱图。结果赖氨葡锌口服溶液经酸破坏后葡萄糖酸锌于5.636 min处产生一个杂质峰,盐酸赖氨酸无明显降解;碱破坏后葡萄糖酸锌无明显降解,盐酸赖氨酸于13.047 min处产生一个杂质峰;氧化破坏后葡萄糖酸锌于6.971 min处产生一个杂质峰,盐酸赖氨酸无明显降解;光照破坏和高温破坏后,二者均无明显降解葡萄糖酸锌溶液经酸破坏和氧化破坏后降解明显,碱破坏、光照破坏和高温破坏无明显影响。盐酸赖氨酸溶液经碱破坏后降解严重,其他破坏条件无明显变化,与赖氨葡锌口服溶液的破坏结果一致。空白对照溶液经上述破坏后对本实验无干扰。见
图2
破坏实验图谱
A.赖氨葡锌口服溶液;B.盐酸赖氨酸;C.葡萄糖酸锌;D.空白溶液
Fig.2
Spectrum of destruction test
A. lysine hydrochloride and zinc gluconate oral solution;B. lysine hydrochloride; C.zinc gluconate;D. blank solution
同时,照《中华人民共和国药典》2015年版二部中关于盐酸赖氨酸有关物质的检查方法对盐酸赖氨酸及赖氨葡锌口服溶液破坏实验样品进行检测,分别取盐酸赖氨酸及赖氨葡锌口服溶液破坏实验样品溶液各6 μL点于同一硅胶G薄层板上,以正丙醇-浓氨溶液(2:1)为展开剂,展开,晾干,喷以茚三酮的丙酮溶液,在80 ℃加热至斑点出现,立即检视,结果见
图3
破坏实验结果(温度:10 ℃;湿度:50%)
1.盐酸赖氨酸溶液破坏;B.口服溶液样品破坏;A1、B1.盐酸赖氨酸未破坏溶液;B2.口服溶液未破坏样品;A2、B3.高温破坏;A3、B4.光照破坏;A4、B5.氧化破坏;A5、B6.强酸破坏;A6、B7.强碱破坏
Fig.3
Result of destruction test(temperature:10 ℃;humidity:50%)
A.destructed lysine hydrochloride;B.destructed oral solution sample;A1 and B1.normal lysine hydrochloride;B2. normal oral solution sample;A2 and B3.heat destruction;A3 and B4. light destruction;A4 and B5. oxidative destruction;A5 and B6. strong acid destruction;A6 and B7. strong alkali destruction
取赖氨葡锌口服溶液用水稀释不同倍数,分别取15 μL注入液相色谱仪,照上述色谱条件实验,记录色谱图。结果在稀释100倍时,葡萄糖酸锌的峰高为噪音的11倍,盐酸赖氨酸的峰高为噪音的12倍,即样品稀释100倍可达到葡萄糖酸锌和盐酸赖氨酸的最低检测限。
精密量取对照溶液15 μL,按上述色谱条件重复进样5次,测定峰面积。结果表明,葡萄糖酸锌和盐酸赖氨酸峰面积测量值的RSD均小于2.0%,说明仪器精密度良好。见
表2 仪器精密度实验
Tab.2 Result of precision test
按“2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液,取15 μL注入液相色谱仪,照上述色谱条件实验,测定峰面积。结果供试品溶液中葡萄糖酸锌和盐酸赖氨酸峰面积的RSD均小于2.0%,且均未出现杂质峰,说明该方法重复性良好。见
表3 重复性实验的考察结果
Tab.3 Result of repeat ability test
取本品供试品溶液,于室温(20~25 ℃)条件下放置,分别于0,2,4,6,8,10 h精密量取15 μL进样,测定峰面积。结果供试品溶液于室温(20~25 ℃)条件下放置10 h,葡萄糖酸锌和盐酸赖氨酸峰面积的RSD均小于2.0%,且均未出现杂质峰,即供试品溶液在室温下保存,10 h内稳定。见
表4 供试品溶液稳定性实验考察结果
Tab.4 Result of stability test on sample solution
2.8.1 不同流动相比例的比较 本实验选用梯度洗脱,其中流动相A对本品中葡萄糖酸锌和盐酸赖氨酸两主峰保留时间影响较大,为考察不同流动相比例对有关物质检查结果的影响,故使用不同流动相A比例,其他色谱条件不变,分别精密量取供试品溶液及对照溶液各15 μL,注入液相色谱仪进行测定。流动相A比例分别为磷酸缓冲液溶液-乙腈34:66,32:68和30:70。结果各峰均可达到较好的分离,表明在一定范围内,不同的流动相A比例对其有关物质检查无影响。
2.8.2 不同检测波长的比较 为考察检测波长的改变对含量测定结果的影响,使用不同的检测波长(±2 nm),即201,203和205 nm,其他色谱条件不变,分别精密量取供试品溶液及对照溶液各15 μL,注入液相色谱仪进行测定。结果各峰均可达到较好的分离,且峰形良好,表明在一定范围内,不同的检测波长对有关物质检查结果无影响。
2.8.3 不同色谱柱的比较 为考察不同色谱柱对含量测定结果的影响,使用不同色谱柱,即Inertsil Amide 柱、Welch Ultimate Polar-Prophylamide柱和Xbridge Amide柱,其他色谱条件不变,精密量取对照品溶液15 μL,注入液相色谱仪进行测定。结果各峰均分离良好,表明在一定范围内,选用不同的色谱柱对其有关物质检查无明显影响,表明该检测方法耐用性良好。见
由于盐酸赖氨酸和葡萄糖酸锌均为末端吸收,故扫描光谱图后选择203 nm作为检查波长。笔者比较了C18色谱柱[6-7]、氨基柱[8]和丙基酰胺键合硅胶色谱柱的性能,由于葡萄糖酸锌极性较强,在C18色谱柱上难以保留,多在4 min以内出峰,对杂质的分离效果有限;葡萄糖酸锌在氨基柱上峰形较差,有拖尾现象,且重复性不好;故最终选择了保留时间适中,峰形较好,耐用性更佳的丙基酰胺键合硅胶柱。葡萄糖酸锌在酸性条件下不稳定,形成葡萄糖酸内酯,盐酸赖氨酸在强碱条件下易降解,在本文建立的方法下,降解产物与主成分和辅料达到完全分离。
笔者首次采用丙基酰胺键合硅胶色谱柱对葡萄糖酸锌和盐酸赖氨酸的有关物质进行同时测定,并对其方法学进行了研究,结果表明该法精密度、专属性和耐用性均良好,能有效分离葡萄糖酸锌和盐酸赖氨酸及其降解产物。本实验填补了葡萄糖酸锌有关物质研究的空白,为葡萄糖酸锌原料及相关制剂的质量控制提供了依据;可用于赖氨葡锌口服溶液中有关物质的检查,为含有赖氨酸和葡萄糖酸锌制剂的有关物质检查提供了新方法。
The authors have declared that no competing interests exist.
