基于主成分分析的菊花抗氧化活性谱-效关系

李婷婷¹^,, 杨书²

成都医学院1.药学院

2.公共卫生系,成都 610083

作者简介李婷婷(1983-),女,重庆人,高级实验师,硕士,研究方向:药物质量评价。E-mail:446197867@qq.com。

基金资助: 四川省教育厅科研项目(13ZB0230)

中图分类号: R286 文献标识码: B 文章编号: 1004-0781(2017)07-0801-04

摘要:

目的研究菊花抗氧化活性的谱-效关系。方法测定菊花样品高效液相色谱(HPLC)指纹图谱,对应测定其1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH^·)、羟自由基(·OH)、超氧阴离子(O2-·)清除能力为抗氧化活性指标,采用主成分方法,分析指纹图谱化学信息与其相应活性信息间的关联。结果提取4个主成分,第1主成分得分与DPPH^·、·OH、O2-·百分含量间的相关系数分别为0.546,0.456,-0.519,差异有统计学意义。结论该方法对筛选菊花药效活性成分,以及质量评价体系的建立有参考作用。

关键词: 菊花 ; 主成分分析 ; 抗氧化活性 ; 谱-效关系

笔者通过主成分分析,定量研究菊花自由基清除活性的谱-效相关性。构建菊花提取物高效液相色谱(HPLC)指纹图谱,以1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH^·)、羟自由基(·OH)、超氧阴离子( $\begin{matrix} O_{2}^{-} \end{matrix}$ ·)清除能力为抗氧化活性指标,利用实验收集到的数据信息,采用数据建模技术拟合统计模型,将测定的HPLC指纹图谱化学信息与其相应活性信息间进行相关性研究。依托模型,探索分析菊花提取物中有效抗氧化活性的组分以及组分间的相互作用。此研究为优化菊花提取生产工艺、筛选药效活性成分、建立能够反映菊花内在质量的质量评价体系等方面提供参考^[[1-5]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Ultimate 3000高效液相色谱仪,DAD检测器(戴安中国有限公司);AS150BD-IU超声波清洗器(天津奥特赛斯有限公司);UV1102紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司);BS224S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司,感量:0.1 mg);DK-$22型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 试剂

1,1-2苯基-2-3硝基苯肼(DPPH,东京化成工业株式会社,批号:CR0032);Tris试剂(上海基星生物科技有限公司,批号:77-86-1);无水乙醇(四川科伦药业股份有限公司,批号:7664-38-2);甲醇(四川科伦药业股份有限公司,批号:67-56-1);邻苯三酚(天津市博迪化工有限公司,批号:20141203);盐酸(四川科伦药业股份有限公司,批号:7558-79-4);甲酸(四川科伦药业股份有限公司,批号:7664-38-2);七水硫酸亚铁(天津市博迪化工有限公司,批号:20140807);以上试剂均为分析纯; 甲醇为色谱纯(SWELL公司,批号:710001111116);乙腈为色谱纯(SWELL公司,批号:710002111116);超纯水由优普系列超纯水机系统制备。

1.3 样品来源

菊花样品:贡菊(产自安徽黄山)、亳菊(产自安徽亳州)、滁菊(产自安徽滁州)、胎菊(产自浙江桐乡)、杭白菊(产自浙江杭州)、怀菊花(产自河南温县)、菊花(产自湖北麻城)、菊花(产自湖北麻城)、菊花(产自湖南怀化),采收时间集中在2012年11月—2013年5月,均购于成都市中药材市场,经成都医学院实验教学中心秦琴实验师鉴定为菊科植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

称取样品菊花粉末[60 ℃烘干24 h,打粉机打粉后过一号筛,筛孔内径(2±0.07) mm]约0.25 g,精密称定,置具塞烧瓶,精密加入95%乙醇25 mL,密塞,浸泡40 min后,用水浴回流装置在70 ℃提取1 h,冷却抽滤,离心(3 000 r·min^-1,r=13.5 cm)20 min,取上清液装于50 mL量瓶中,补液至50 mL,摇匀,滤过后,待用。

2.2 液相色谱条件

色谱柱SWELL Chromplus C₁₈(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温:25 ℃;进样量:10 μL。流速:0.8 mL·min^-1,检测波长:350 nm。流动相:0.3%甲酸溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脱。洗脱程序见表1。

检测时间/min	甲酸溶液(A)	乙腈(B)
0	90	10
25	90	10
80	82.5	17.5
90	79	21
110	74	26
125	70	30
150	60	40

表1 梯度洗脱顺序表 %

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度实验取菊花(产自安徽黄山)粉末0.25 g,精密称定,按“2.1”项制备供试品溶液,按“2.2”项色谱条件连续进样6次。对各共有峰相对峰面积和相对保留时间进行比较,并分别计算RSD值。结果各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均<3.0%,表明系统具有良好的精密度。

2.3.2 重复性实验取同一供试品粉末0.25 g,精密称定,平行6次,按“2.1”项制备供试品溶液,按“2.2”项色谱条件测定。对各共有峰相对峰面积和相对保留时间进行比较,并分别计算其RSD。结果各共有峰相对峰面积和相对保留时间RSD值均<3.0%,表明本实验具有良好的重复性。

2.3.3 稳定性实验取同一供试品0.25 g,分别于配制后0,3,6,9,12,15 h按“2.2”项色谱条件测定,记录色谱峰。对各共有峰相对峰面积和相对保留时间进行比较,并分别计算RSD,结果各共有峰相对峰面积和相对保留时间RSD值均<3.0%,结果表明供试品溶液在15 h内稳定性良好。

2.4 指纹图谱测定

10批菊花的指纹图谱采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)》进行数据处理,并按峰面积大小对图谱中较大25个峰进行编号标记,见图1。

图1 10批菊花样品指纹图谱及色谱峰标记图

2.5 DPPH清除能力的检测

取“2.1”项样品稀释液1 mL至试管,加入0.04 g·L^-1DPPH溶液(无水乙醇配置)3 mL,震荡混合均匀,常温下密封后置于避光处反应30 min,于517 nm波长处测定吸光度(A₁),对照组则用相同体积的样品溶液辅料代替样品溶液,于517 nm处测定吸光度(A₂)。无水乙醇作为空白对照,平行测定3次,结果见表2。清除率(%)=(1-A₁/A₂)×100%。

表2 DPPH ^·,·OH,O2-·法实验结果 %

菊花(来源)	DPPH^·			·OH			O2-·
菊花(来源)	清除率		%		清除率	%	清除率	%
贡菊(安徽黄山)	82.05	0.54		26.84	0.97		28.95	1.79
亳菊(安徽亳州)	55.03	0.44		37.77	0.87		29.52	1.66
滁菊(安徽滁州)	87.19	0.57		35.69	0.91		29.57	0.80
胎菊(浙江桐乡)	47.52	0.85		39.39	0.10		28.53	0.87
杭白菊(浙江杭州)	87.15	0.85		39.03	1.46		28.26	1.06
怀菊花(河南温县)	85.87	0.43		35.03	2.02		29.29	0.42
怀菊花(河南温县)	64.34	0.35		46.01	1.15		29.46	1.11
菊花(湖北麻城)	87.23	0.26		33.66	1.30		28.93	0.17
菊花(湖北麻城)	74.09	0.67		40.18	0.99		29.29	1.71
菊花(湖南怀化)	65.85	1.01		46.81	0.10		28.38	1.90

表2 DPPH ^·,·OH,O2-·法实验结果 %

2.6 超氧阴离子清除能力的检测

取50 mmol·L^-1Tris-盐酸缓冲液(pH值=8.2)2.0 mL于试管中,置于25 ℃水浴中预热20 min,加入“2.1”项样品稀释液1 mL和3 mmol·L^-1邻苯三酚溶液(10 mmol·L^-1盐酸配制,25 ℃水浴中预热)0.3 mL,震荡混匀后于25 ℃水浴中反应5 min,最后加入10 mol·L^-1盐酸5滴终止反应,于320 nm处测定吸光度(A₁),对照组以相同体积的样品溶液辅料代替样品溶液,320 nm处测定吸光度(A₂)。平行测定3次,结果见表2。

2.7 羟自由基清除能力的测定

在试管中分别加入4 mmol·L^-1硫酸亚铁溶液、4 mmol·L^-1水杨酸溶液、4 mmol·L^-1过氧化氢溶液各1 mL,震荡摇匀后置于37 ℃水浴中反应10 min,于波长510 nm 处测定吸光度(A₁),再加入“2.1”项样品稀释液1 mL,震荡摇匀,再放于37 ℃水浴中反应10 min,于波长510 nm 处测定吸光度(A₂)。平行测定3次,结果见表2。

2.8 “谱-效”关系

图谱中编号标记25个峰,见图1。将这25个主峰(F1~F25)进行主成分分析,结果见表3。

表3 主成分矩阵

峰号	第1主成分	第2主成分	第3主成分	第4主成分
F1	0.866	0.023	0.405	0.174
F2	0.298	0.925	0.186	0.088
F3	0.703	0.697	0.074	0.055
F4	-0.633	0.735	-0.160	-0.131
F5	0.364	-0.857	-0.258	-0.054
F6	0.815	-0.238	-0.471	-0.193
F7	-0.070	-0.025	0.819	-0.291
F8	0.508	0.539	0.474	0.172
F9	0.266	0.889	0.345	-0.041
F10	-0.507	0.842	-0.088	-0.168
F11	-0.773	0.591	-0.029	-0.187
F12	-0.758	0.623	-0.096	-0.130
F13	0.773	0.621	0.044	-0.014
F14	0.882	0.437	0.043	0.132
F15	-0.656	0.643	-0.247	-0.279
F16	-0.213	0.850	0.301	0.342
F17	0.967	0.105	0.186	0.072
F18	0.765	0.505	-0.379	-0.073
F19	0.970	0.209	-0.108	-0.032
F20	-0.588	0.605	-0.291	0.248
F21	-0.688	0.618	-0.091	0.317
F22	-0.219	-0.614	0.711	-0.224
F23	0.868	0.296	-0.356	-0.174
F24	-0.277	-0.532	-0.191	0.698
F25	0.860	0.361	-0.319	-0.098

表3 主成分矩阵

计算主成分得分,将主成分得分与DPPH^·%、·OH%、 $\begin{matrix} O_{2}^{-} \end{matrix}$ ·%之间计算Pearson相关系数,得相关系数矩阵,见表4。

项目	DPPH^·	·OH	O2-·
第1主成分得分	0.546^*1	0.456^*1	-0.519^*1
第2主成分得分	-0.051	-0.388	-0.044
第3主成分得分	-0.029	0.108	0.391
第4主成分得分	0.377	-0.334	-0.117

表4 相关系数矩阵 %

将表3中系数绝对值>0.5以及表4中相关系数有统计学意义的关联加入图1,制作谱效关联图,见图2,其中红色线表示系数为正,蓝色线表示系数为负。由于只有第1主成分得分与样品中代表抗氧化活性组分间的相关系数差异有统计学意义,故其余主成分列出但未画线。

图2 谱效关联图

根据同号相乘为正的原理,可推测菊花提取液的DPPH^·%、·OH%、 $\begin{matrix} O_{2}^{-} \end{matrix}$ ·%清除率与25个主峰之间的关系,如果在谱效间是两根同色线段(同红或同蓝),则表示谱效间存在某种正关联,如果是两根不同颜色的线段,则表示负关联,提示谱所代表的成分与样品中代表抗氧化活性组分可能有某种拮抗关系。

3 讨论

中药色谱指纹图谱实际上是中药整体性的化学表征,具有整体性和模糊性^[6]。笔者利用主成分分析的降维作用,可以使谱-效关联的研究更加简洁直观,也可初步判断并排除干扰峰。

本研究依托主成分分析,在主成分提取后,计算4个主成分得分与代表抗氧化活性的DPPH^·%、·OH%、 $\begin{matrix} O_{2}^{-} \end{matrix}$ ·%等3种组分间Pearson相关系数,结合在主成分分析中得到的4个主成分与25个峰面积间的相关系数矩阵,以主成分得分为媒介,间接判断“谱”(25个主峰)与“效”(代表抗氧化活性组分)间的统计学关联。

由表4可知,仅有第1主成分得分与3种抗氧化组分间的相关系数有统计学意义,提示第1主成分与“效”间存在相关关系。结合表3中第1主成分与25个峰面积的关联,可做如下分析:第1主成分与DPPH^·%的相关系数为0.546,第1主成分与F1、F3、F6、F8、F13、F14、F17、F18、F19、F23、F25的相关系数均>0.5,提示抗氧化活性组分DPPH^·%的含量与谱中上述几个峰有关;第1主成分与 $\begin{matrix} O_{2}^{-} \end{matrix}$ ·%间的相关系数为-0.519,第1主成分与F4、F10、F11、F12、F15、F20、F21间的相关系数绝对值均>0.5,且系数为负,根据负负得正的原理,提示组分 $\begin{matrix} O_{2}^{-} \end{matrix}$ ·%的含量与谱中上述几个峰有关;F2、F5、F7、F9、F16、F22、F24与第1主成分相关系数绝对值较小,可能为与组分无关的其他成分。

本研究借助统计建模方法对“谱”“效”间关联进行初步分析,由于建模对数据有较强的依赖性,不同样本可能会产生不同结果,说明小样本研究的稳定性还有局限,对“谱” “效”间关联系数的解释也带有一定主观性。作为探索性研究,可为以后的研究提供思路。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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