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美国《化学文摘》《国际药学文摘》
《乌利希期刊指南》
WHO《西太平洋地区医学索引》来源期刊
日本科学技术振兴机构数据库（JST）
第七届湖北十大名刊提名奖
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第七届湖北十大名刊提名奖
, 徐健, 李娟
, XU Jian, LI Juan,
该文对卷柏属药用植物抗氧化作用及其物质基础的研究进行介绍和评述。在对卷柏属多种药用植物进行系统比较鉴定研究的基础上,发现其乙酸乙酯部位(EtAc)及黄酮类化合物对黄嘌呤氧化酶(XOD)、脂质氧化酶(LOX)或(和)环氧化酶-2(COX-2)均具有一定程度的抑制活性。从该属3种资源植物分离获得14种双黄酮、1种黄酮类化合物、5种黄酮苷化合物,其中新化合物5种,并首次从这些植物中发现了15种成分。穗花杉双黄酮(AME)、罗伯斯塔黄酮和罗伯斯塔黄酮-4'-甲醚双黄酮3种成分为卷柏属植物共同的抗氧化特征性成分,可作为其共同的活性成分指标用以评价其品质。数种卷柏属药用植物具有较强的抗柯萨奇病毒作用及抗肿瘤作用,这与它们能整体多靶点抑制多种氧化酶、减少自由基对组织的损伤密切相关。
This paper aimed to introduce and review the antioxidant and material base of selaginella medicinal plants. On the basis of the systematic identification of selaginella medicinal plants, we found that the ethyl acetate extract and flavonoids could inhibit the activity of XOD, LOX or/and COX-2 to some extent. Fourteen biflavonoids, one flavonoid and five flavonoid glycosides have been isolated from three resource plants, among them five compounds were firstly reported and fifteen compounds were firstly isolated in selaginella plants. Amentoflavone (AME), robustaflavone and robustaflavone-4'-dimethylether are three common characteristic constituents of selaginella plants, which can act as marks of common active ingredients and be applied to evaluate the quality of selaginella. Further studies found that some plants had stronger anti-Coxsackie virus and anti-tumor effects, and their mechanisms were associated with inhibiting multiple oxidase and mitigating harm of free radicals due to whole function.
卷柏属药用植物具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用,从中已分离得到一些活性成分,大多为双黄酮类化合物[1]。这些成分在植物中含量一般很低、作用温和,那它们如何能有效地起作用呢?在前期研究中,万定荣等[2]发现卷柏属中的药用植物细叶卷柏的提取物治疗乙型肝炎有效,对黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)、脂质氧化酶(lipoxygenase,LOX)和环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制活性较强,分析卷柏属植物抗炎、抗肿瘤、抗病毒等作用可能与其成分多靶点抑制XOD、LOX和COX-2等氧化酶有关[3-5]。笔者对卷柏属药用植物多靶点抑制上述3种氧化酶的活性作用及其物质基础进行综述,探讨其新的抗病毒和抗肿瘤作用,为卷柏属植物资源的合理开发利用提供理论依据。
卷柏属药用植物的形态极为类似,容易混淆。因此,首先确定其原植物物种和建立药材鉴定方法是进行活性研究的基础。本项目对湖北省卷柏属药用植物进行了资源调查,建立了卷柏属药材系统鉴定的方法,为活性成分及其作用研究打下了基础。
该项研究对湖北省内8个县、10多个采集点的卷柏属植物进行了资源调查[5],收集标本100余份,获知了湖北卷柏属植物的品种与药用情况。经鉴定整理,发现湖北省卷柏属植物共计15种,与最新出版的《中国植物志》第六卷(3)记载的13种相比多了2种。其中药用种14种,其余1种(异穗卷柏)为湖北地理分布新记录种。
1.2.1 卷柏属10个种的茎横切面显微结构的比较 万定荣等[6]研究发现卷柏属10种植物茎的显微特征差异明显,这些茎的显微结构可以准确区别属内10个种的药材,同时也依据茎的结构解决了形态学分类上难以解决的难题。如异穗卷柏在形态上有的植株的营养枝与孢子枝同株,而有的植株仅有独立的孢子枝而不含营养枝,这就造成二者极易被误判为2个不同的种,但研究发现其二者在解剖学特征上相差无几[7];又如薄叶卷柏在外形上即可分为2个类型,结构分析表明其适宜作为变种处理,因其茎具有小而壁薄的表皮细胞、大而壁厚的厚壁细胞以及略大的管胞、气室等特征[8]。
1.2.2 薄层色谱和含量测定 万定荣等[9]以穗花杉双黄酮(amentoflavone,AME)为对照品,以薄层色谱法对5种卷柏属药材进行鉴定研究,发现各药材具有较大的相似性;其区别点体现在斑点数目、位置及颜色深浅上,因此可用于卷柏属植物之间的鉴别。如卷柏与垫状卷柏具有5个共同的色谱斑点,这表明二者具有类似的化学组成,作为中药卷柏的来源有合理性,但是卷柏比垫状卷柏多3个颜色较浅的斑点,可用于二者之间的鉴别。
1.2.3 红外和近红外分析 对10种卷柏属植物的药材共13份样品的粉末进行了红外光谱扫描 [10],结果显示,10种植物有共同的共有峰,但不同的种在峰强度上各有差异,此外每个种均有特征峰。检测结果还显示同种植物不同变异类型、不同采集期或不同生境的样品,其光谱图形状、峰位和峰的数目具有稳定性,但在峰强度上有一定差异,对种内样品及其质量的宏观鉴别有一定意义。用近红外光谱法对10种卷柏属药材的谱图进行了聚类分析[11],发现卷柏属植物的种间亲缘关系与形态学指标做出的判断十分吻合,可解决形态学特征难以解决的分类鉴定问题[12]。
1.2.4 卷柏属药用植物的随机扩增多态性DNA标记分析 李娟等[13]通过对60个随机引物中筛选出的8个引物,采用随机扩增多态性DNA标记技术,扩增和分析了8种本属植物的DNA提取物共计17份样品,共扩增出58个位点,得到了清晰的随机扩增多态性DNA标记图谱,并对8种卷柏属植物类群亲缘关系采用聚类分析法建立了树系结构图。该法证实8种卷柏属植物之间种间差异明显,不同产地的同一种植物也具变异,因此该法能为这些植物种及种下的分类鉴别提供遗传学依据。
1.2.5 卷柏属药用植物的叶缘显微结构 刘葭等[14] 选取卷柏属植物主茎中部的叶进行制片观察,发现卷柏属11种药用植物在叶缘细胞的形状、排列、细胞壁的壁孔和刺状细胞的形态、结构和长度等方面具有稳定和独特的形态和结构特征,可作为该属植物分类及药材鉴别的依据,同时该法也对蕨类植物及其药材的鉴别提供了一种新的观察模式和鉴别方法。
1.3.1 10种卷柏属药用植物的双黄酮类成分的高效液相色谱(HPLC)指纹特征 范晓磊等[15] 对10种卷柏属植物的化学成分进行了HPLC指纹特征研究,发现10种卷柏属植物中有5个主要的双黄酮指纹特征峰,相对保留值α分别为1,1.052,1.169,1.246 和1.368,其中前二者不仅为共有峰而且峰面积较大,而后三者在色谱峰中具有较高的出现频率。以上5个峰的完整性及其相互之间峰面积或峰高之比,对该属植物的鉴定和品质评价具有重要的参考意义。如卷柏和垫状卷柏具有3个共同点和1个明显区别点:二者有共有峰7个,且为强峰;5个主要的特征峰中第一、第二特征峰完全吻合,比例相近;均不含α值为1.169的特征峰,这表明二者的化学成分有很大程度的相似性,说明《中华人民共和国药典》中二者均作为中药卷柏的来源具其合理性。明显区别点是:二者的指纹图谱中第三号强峰在主要特征峰中的位置不同。
1.3.2 10种卷柏属药用植物共同的双黄酮活性成分 范晓磊等[15] 研究发现卷柏属10种药用植物具有3种共同的双黄酮活性成分,分别为AME、罗伯斯塔双黄酮和罗伯斯塔-4'-甲醚双黄酮。其中AME是一种已知的磷酸酯酶抑制药和呼吸道合胞体病毒(RSV)抑制药,半数抑制浓度(IC50)值分别为29和5.5 μg·mL-1;罗伯斯塔双黄酮对乙肝病毒具有较强的抑制作用,此二者均为强抗氧化剂;罗伯斯塔-4'-甲醚双黄酮是XOD、COX和LOX的温和抑制药。因此,对这3个指纹峰的分析识别在品质评价方面具有重要参考价值,可在临床上指导卷柏属药用植物的应用。
1.3.3 卷柏属药用植物的黄酮苷类成分的HPLC指纹特征 研究发现8种卷柏属药用植物均有杀锥虫活性成分芹菜素-6,8-二-C-β-D-吡喃葡萄糖苷;卷柏属不同物种水溶性成分的指纹特征差异明显,可作为药材鉴别和品质评价的参考依据[16]。
研究发现卷柏属7种药用植物EtAc和95%乙醇提取部位均可抑制XOD活性,其中翠云草EtAc和细叶卷柏乙醇提取物是抑制活性较强的部位[17];同时发现8种双黄酮化合物均有XOD抑制活性[18-19](
表1 8种双黄酮及1种总黄酮对XOD活性的影响
Tab.1 Influence of eight biflavones and one flavonoid on XOD activity
表2 3种双黄酮及1种总黄酮对XOD活性的影响
Tab.2 Influence of three biflavones and one flavonoid on XOD activity
黄嘌呤(XO)和次黄嘌呤(Hx)可被XOD催化氧化生成尿酸和过氧化物自由基,而痛风的产生正是由于尿酸在人体内的过度累积造成,此外过氧化物自由基引发的脂质过氧化反应涉及多种病理过程如炎症、癌症和衰老等。所以,卷柏属药用植物对XOD活性的抑制可减少自由基引发的应激反应和对组织的损伤,有望成为临床上治疗或辅助治疗痛风的药物而被开发利用。当前临床治疗痛风的药物别嘌呤醇和秋水仙碱等具有较大副作用。卷柏属药用植物在我国用于各种疾病治疗的时间悠久,笔者未见有关其有明显毒性的报道。因此,该研究对寻求高效低毒的天然抗痛风的XOD抑制药提供了新的实验依据。
研究发现7种卷柏属植物EtAc和95%乙醇提取物对LOX显示较强活性,前者IC50一般<10 μg·mL-1;后者则一般<15 μg·mL-1 [20];发现卷柏属3种药用植物的17份单体和混合物的样品都对LOX有抑制作用,其中9个样品的IC50<10 μg·mL-1,包括AME、罗伯斯塔双黄酮、罗伯斯塔双黄酮-4'-甲醚,抑制活性较强[21](
LOX涉及白三烯、花生四烯酸、前列腺素等的生物合成途径并可诱导脂肪酸的氧化,这些与炎症、硬化、癌症等疾病的发生有一定联系[3]。该研究从整体上比较了卷柏属药用植物提取物对LOX活性的抑制及其强度,这对于了解该属植物抗炎、预防一些疾病(如肿瘤)的作用机制,具有临床指导意义。
表3 卷柏属药用植物化学成分对LOX活性的抑制作用
Tab.3 Inhibition of chemical constituents of selaginella medicinal plants on LOX activity
实验发现江南卷柏和翠云草的总黄酮对结肠癌HT-29细胞生长有显著抑制作用,两种总黄酮在10~40 μg·mL-1浓度范围内能明显抑制COX-2 mRNA的表达[22-23];从江南卷柏和细叶卷柏中分离获得的6种双黄酮化合物和1种黄酮碳苷类成分,对结肠癌HT-29的COX-2的表达在mRNA水平上具有抑制作用[21-24]。
COX-2对炎症以及很多肿瘤的发生和发展起着至关重要的作用。该项目通过深入调查卷柏属药用植物及其活性成分对COX-2的抑制作用,以诠释其抗炎和抗肿瘤的作用机制。
某些卷柏属药用植物的总提取物或提取部位的活性较强,有些甚至较单体化合物活性成分强。研究发现垫状卷柏中3种双黄酮化合物的混合物Fr5对XOD有强抑制作用(IC50为1.1 μg·mL-1),Fr5继续分离获得的两种成分Fr5-1(IC50 2.9 μg·mL-1)和Fr5-2 (IC50 24.0 μg·mL-1),虽然纯度增高但其抑制活性不及Fr5,当用不同浓度的这两种化合物重新组合时,活性仍不能恢复或增强[19]。这说明垫状卷柏中双黄酮成分的抗氧化活性作用不只表现于单一成分的简单加和,还表现出各单一成分协同增效的作用。研究显示该混合物醇溶性良好,但分离后的组分在醇溶液中很难溶解,而这种改变不能通过直接混合得到恢复,反映了中药化学成分相互作用的复杂性,应当引起药物开发研究工作的注意。鉴于总提取物或提取部位的活性较强,同时含量较大,提取方便,因此较之单一的活性强的化合物在开发研究中有较大的优势。
鉴于活性筛选出的抗氧化作用最强的药用植物分别是翠云草、江南卷柏、薄叶卷柏、细叶卷柏、卷柏和垫状卷柏等。而对卷柏、垫状卷柏及薄叶卷柏的化学成分的研究报道较多,研究较透切,因此本项目主要对国内资源丰富且临床应用较多的细叶卷柏、江南卷柏、翠云草等3种植物进行活性部位的化学成分研究。从该属3种资源植物的抗氧化的活性部位中分离获得14种双黄酮、1种黄酮、5种黄酮苷类化合物,其中新化合物4种,首次从这些植物中发现的成分有20种。研究发现这些成分对XOD、LOX或(和)COX-2的活性均有一定抑制作用,其中一些还有显著的抗病毒或抗肿瘤活性。
从江南卷柏EtAc中分离和鉴定了6个双黄酮类化合物:鸡毛松双黄酮A(Ⅰ)、鸡毛松双黄酮B(Ⅱ)、罗伯斯塔黄酮-4'-甲醚(Ⅲ)、罗伯斯塔黄酮(Ⅳ),扁柏双黄酮(Ⅴ)和穗花杉双黄酮(Ⅵ)。其中首次从该植物中分离获得化合物Ⅰ~Ⅴ;化合物Ⅰ和Ⅱ属于罗伯斯塔黄酮类,仅在裸子植物罗汉松科的鸡毛松有过报道,这是从其他植物中首次发现的新的鸡毛松双黄酮的资源植物[27]。
从江南卷柏正丁醇部位分离并鉴定了4个黄酮碳苷和1个黄酮氧苷化合物,分别为芹菜素-6,8-二-
从翠云草活性部位中分离和鉴定了5个双黄酮类化合物:AME (Ⅰ)、罗伯斯塔双黄酮(Ⅱ)、罗伯斯塔-4'-甲醚(Ⅲ)、2″,3″-二氢-4'-甲氧基-AME(Ⅳ)、7″-甲氧基四氢扁柏双黄酮(Ⅴ)。其中首次从翠云草中分离获得化合物Ⅱ、Ⅲ,而新化合物有Ⅳ、Ⅴ[28]。
研究发现几种卷柏属药用植物提取物具有一定抗疱疹病毒Ⅰ和柯萨奇病-3(CVB3)的作用[29-32];江南卷柏总黄酮及其主要成分AME具有显著抗CVB3的作用[31]。江南卷柏总黄酮体外直接抑制病毒生长和抑制病毒生物合成的IC50分别为36和16 μg·mL-1,AME抑制病毒生长和抑制病毒生物合成的IC50分别为52和25 μg·mL-1。研究发现每天服用300 mg·kg-1的江南卷柏总黄酮提取物能显著减少染毒小鼠心脏和肾脏中病毒的滴度,小鼠死亡率显著下降[33]。
CVB与人类多种疾病有着密切的联系,病毒性心肌炎主要由CVB3引起,然而由于缺乏有效的药物,随着病情发展许多患者最终死于心力衰竭。本研究从细胞实验到动物实验发现江南卷柏总黄酮能有效抑制CVB3的增殖,为江南卷柏总黄酮应用于病毒性心肌炎提供了潜在的应用前景。
通过对几种肿瘤细胞株的比较研究发现:细叶卷柏、 翠云草、卷柏的乙酸乙酯提取物的抗肿瘤活性相对较强,江南卷柏和深绿卷柏的细胞毒作用相对温和,而疏叶卷柏和垫状卷柏几乎无细胞毒作用[34-38]。 深入研究深绿卷柏的抗肿瘤作用发现,乙酸乙酯活性部位对正常细胞株毒性较低,体外瘤鼠模型同样具有较强的活性,其抑制肿瘤细胞生长及促进凋亡作用和调节bcl-2和bax基因的表达,激活casepase-3从而抑制survivin,降低COX-2、5-LOX、FLAP和12-LOX mRNA等的表达有关,分子对接结果显示,双黄酮化合物与COX-2、5-LOX、12-LOX和15-LOX显示了较强的相互作用[38]。其中细叶卷柏双黄酮组分不仅可以抑制肿瘤细胞生长,同时从其乙酸乙酯部位分离得到的编号为4021619A的组分(4种相近的黄酮类化合物)和单体化合物(2″,3″-dihydroochnaflavone)被发现有显著的诱导肿瘤细胞凋亡作用[35]。
卷柏属植物是我国特有的药用资源植物之一,其分布广泛,资源丰富,生命力特别旺盛。对其活性的研究和品质评价具有重要的意义。编号为30470193的国家自然科学基金资助项目对卷柏属药用植物的研究主要包括:①完成了卷柏属药用植物的资源调查和系统鉴别研究;②建立了卷柏属药用植物的化学指纹特征图谱,发现均具有3种双黄酮和1种黄酮苷活性成分;③发现本属植物是XOD、LOX、COX-2活性抑制剂,并从该属植物中分离得到多种双黄酮和黄酮苷化学成分,具有明显的多种抗氧化作用;④发现该属植物具有新的抗病毒(柯萨奇病毒)和新的抗肿瘤等活性。
The authors have declared that no competing interests exist.
