注射用兰索拉唑安全性的比较及聚类分析

邬姗, 黄凤娇, 王平慧, 吕晓君, 何开勇

湖北省药品监督检验研究院,武汉 430064

WU Shan^,, HUANG Fengjiao^,, WANG Pinghui, LYU Xiaojun, HE Kaiyong

Hubei Institute for Drug Control, Wuhan 430064, China

作者简介邬姗(1993-),女,湖北武汉人,主管药师,硕士,主要研究方向:药品检验。电话:027-87271327,E-mail:191478145@qq.com。

通信作者黄凤娇(1976-),女,湖北建始人,副主任药师,硕士,主要研究方向:药品检验。电话:027-87271327,E-mail:191478145@qq.com。

中图分类号: R975;R927.1 文献标识码: A 文章编号: 1004-0781(2018)06-0659-03

摘要:

目的探索聚类分析方法在药品安全性评价中的应用。方法 12家生产企业(编码为A~L)生产的12批注射用兰索拉唑进行溶血实验、肌肉刺激实验、体外细胞毒性实验,根据上述3个变量采用聚类分析法对12家生产企业进行分类。结果 12家生产企业可以分为3类,生产企业K为一类,A、C、D、E、F、I为一类,B、G、H、J、L为一类。结论 12家生产企业生产的注射用兰索拉唑安全性存在较大差异;聚类分析可用于药品安全性评价。

关键词: 兰索拉唑 ; 注射用 ; 聚类分析 ; 安全性

Abstract:

Objective To explore cluster analysis in the evaluation of drug safety. Methods Totally, 12 batches of lansoprazole for injection produced by 12 manufacturers (code A-L) were subjected to hemolysis test, muscle stimulation test, in vitro cytotoxicity test, and 12 manufacturers were classified by cluster analysis according to the above three variables. Results The 12 manufacturers can be divided into three classes: production enterprise K in a class; A, C, D, E, F, I in a class; B, G, H, J, L in a class. Conclusion The safety of lansoprazole for injection produced by the 12 enterprises was obviously different. Cluster analysis could be used in drug safety evaluation.

Key words: Lansoprazole for injection ; Cluster analysis ; Safety

兰索拉唑为质子泵抑制药,通过抑制H⁺-K⁺-ATP酶的活性抑制胃酸分泌,临床用于胃及十二指肠溃疡、反流性食道炎、胃泌素瘤等的治疗^[1]。注射用兰索拉唑是2016年国家评价性抽验的品种,注射药物的安全性评价是药物临床实验的一个重要组成部分。目前,国内外对注射用兰索拉唑的安全性研究主要由体外溶血实验、家兔肌肉刺激性实验、细胞毒性实验等组成^[2],但尚不能全面反映注射用兰索拉唑的总体安全状况以及作为整体安全性评价手段。笔者结合药品安全性检验的特点,通过溶血实验、肌肉刺激性实验、细胞毒性实验3项变量对12家生产企业共12批注射用兰索拉唑进行聚类分析,比较注射用兰索拉唑不同生产企业安全性差异,这是在药品安全评价过程尝试用聚类分析的方法对生产企业进行分类,为药物安全用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

普通级日本大耳白兔36只,雌雄兼用,体质量为2.3~2.8 kg,由武汉市万千佳兴生物科技有限公司提供,动物生产许可证号:SCXK(鄂)2011-0011。

1.2 细胞株

L929,购自中国典型培养物保藏中心。

1.3 仪器设备

KR-20000T离心机(日本KUBOTAKR公司);BHW2电热恒温水浴箱(北京医疗设备厂);TV1901紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);AB204-S电子天平(瑞士梅特勒-托利多有限公司,感量:0.1 mg);XDS-1B倒置光学显微镜(索尼公司);HF90二氧化碳培养箱(HEAL FORCE);VS-1300L-U超净工作台(AIRTECH公司);G154DW高压灭菌锅[致微(厦门)仪器有限公司];BIO-RED TC20细胞计数仪;Spark 10M 多功能酶标仪(瑞士TECAN)。

1.4 试药

0.9%氯化钠溶液(武汉滨湖双鹤药业有限责任公司,批号:1605050301,规格:每瓶100 mL);RPMI1640培养基(GIBCO公司,批号:1718766);新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司,批号:140206);高密度聚乙烯(广东省茂名乙烯厂,批号:090702413);二甲亚砜(DMSO,Sigma公司,批号:RNBB4297);噻唑蓝(MTT,MKBP6775V)。注射用兰索拉唑,编号A~L,规格:每支30 mg。

1.5 方法

1.5.1 溶血实验参照文献[3,4]。取供试品1支(30 mg),加0.9%氯化钠溶液2.5 mL,振摇溶解,定容至15.0 mL,即得2 mg·mL^-1供试品溶液。供试品A~L配制方法相同。每个组取洁净试管7支,进行编号,1~5号管为供试品管,另外分别设阴性对照管和阳性对照管各1管,每个生产企业平行做6只家兔的溶血实验。依次加入2%红细胞混悬液和氯化钠注射液或纯化水,混匀,置37 ℃恒温水浴中,3 h后1 000 r·min^-1离心10 min,吸取上清液移入比色皿内,用分光光度计在545 nm波长处测定吸光度,并计算各生产企业溶血积分(溶血积分=5×A_{0.1 mL} +4×A_{0.2 mL}+3×A_{0.3 mL} +2×A_{0.4 mL} + A_{0.5 mL})。

1.5.2 肌肉刺激性实验参照文献[3]。取注射用兰索拉唑1支,加0.9%氯化钠溶液10 mL,溶解混匀,浓度为3 mg·mL^-1。供试品A~L配制方法相同。将36只大耳白兔分成12组,每组3只,采用同体左右自身对比法,家兔左侧股四头肌分别给予样品A~L,右侧股四头肌给予0.9%氯化钠溶液。注射体积均为每侧1 mL,一次给药。给药后72 h观察注射局部的刺激反应,如充血、红肿等。计算肌肉刺激性平均值,判定刺激等级。

1.5.3 体外细胞毒性实验参照文献[5]。采用MTT比色法,将制备成1×10⁴·mL^-1细胞悬液接种于96孔培养板,设空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和供试品组(供试品组设4个浓度:300,150,75,37.5 μg·mL^-1),每组各设6孔,每孔接种细胞悬液100 μL,置二氧化碳培养箱37 ℃培养24 h后,弃去原培养液。空白对照组加入含10%血清RPMI1640培养液,阴性对照组加入高密度聚乙烯浸提液,阳性对照组加入5%DMSO溶液,供试品组加入不同浓度的供试品溶液,每孔100 μL。置二氧化碳培养箱37 ℃继续培养72 h后,每孔加入5 g·L^-1 MTT溶液20 μL,继续培养4 h后弃去孔内液体,加入DMSO溶液150 μL,置振荡器上振荡10 min,在酶标仪570和630 nm波长下测定吸光度。计算相对增殖率(RGR),RGR(%)=(A/A₀)×100%,A为供试品组、阴性对照组、阳性对照组,A₀为空白对照组。根据RGR对样品A~L进行分级。

1.6 统计学方法

采用SPSS17.0版统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差( $\bar{x}$ ±s)表示。聚类分析采用系统聚类分析法,聚类方法采用组间连接法,距离测度方法采用欧氏距离平方法。

2 结果

2.1 溶血实验

12个厂家注射用兰索拉唑的吸光度值及溶血积分见表1。阴性对照组A值为(0.019±0.007),阳性对照组A值为(0.726±0.127)。

表1 注射用兰索拉唑溶血反应吸光度和溶血积分
Tab.1 Results of absorbance and hemolytic reaction of lansoprazole for injection x¯±s,n=6

生产企业	A值					溶血积分
生产企业	0.1 mL	0.2 mL	0.3 mL	0.4 mL	0.5 mL	溶血积分
A	0.049±0.018	0.095±0.063	0.219±0.145	0.346±0.180	0.511±0.126	2.484±1.079
B	0.064±0.023	0.219±0.119	0.414±0.159	0.614±0.093	0.724±0.100	4.391±1.055
C	0.032±0.008	0.063±0.035	0.155±0.097	0.287±0.159	0.448±0.137	1.864±0.740
D	0.035±0.019	0.090±0.046	0.210±0.129	0.336±0.147	0.484±0.117	2.269±0.855
E	0.037±0.009	0.092±0.040	0.220±0.103	0.368±0.111	0.510±0.079	2.456±0.721
F	0.048±0.012	0.124±0.049	0.280±0.125	0.437±0.119	0.583±0.082	3.032±0.792
G	0.059±0.013	0.174±0.086	0.344±0.132	0.524±0.089	0.633±0.081	3.701±0.911
H	0.091±0.028	0.304±0.137	0.578±0.087	0.726±0.105	0.786±0.127	5.643±0.756
I	0.036±0.011	0.087±0.039	0.200±0.119	0.322±0.130	0.453±0.109	2.219±0.833
J	0.051±0.017	0.207±0.100	0.380±0.138	0.562±0.088	0.669±0.076	4.017±0.941
K	0.023±0.010	0.033±0.009	0.064±0.027	0.137±0.048	0.256±0.115	0.969±0.320
L	0.056±0.019	0.266±0.120	0.497±0.120	0.643±0.082	0.732±0.105	4.851±0.907

表1 注射用兰索拉唑溶血反应吸光度和溶血积分

Tab.1 Results of absorbance and hemolytic reaction of lansoprazole for injection x¯±s,n=6

2.2 肌肉刺激性实验

结果见表2。根据12个生产厂家注射用兰索拉唑肌肉刺激平均分值,样品A、C、E、G、J、L为轻微刺激,样品B、D、F、H、I、K为轻度刺激。

生产企业	平均分值	分级		生产企业	平均分值	分级
B	2.3	轻度	H	2.0	轻度
C	1.3	轻微	I	1.7	轻度
D	2.3	轻度	J	1.0	轻微
E	0.7	轻微	K	2.0	轻度
F	1.7	轻度	L	1.0	轻微

表2 注射用兰索拉唑肌肉刺激评分结果

Tab.2 Scores of muscle stimulation test on lansoprazole for injection n=3

2.3 体外细胞毒性实验

结果见表3。注射用兰索拉唑在浓度300,150 μg·mL^-1下,12个厂家注射用兰索拉唑细胞分级均为4级;在75 μg·mL^-1浓度下,生产企业A、D、E、F、G、H、I、L细胞分级均为4级,生产企业B、C、J、K细胞分级均为3级;在37.5 μg·mL^-1浓度下,生产企业A、B、C、D、E、F、G、H、J、K、L细胞分级均为2级,生产企业I细胞分级1级。

表3 注射用兰索拉唑细胞毒性评级结果
Tab.3 Grade of cytotoxicity test on lansoprazole for injection n=6

生产企业	浓度/ (μg·mL^-1)	RGR/ %	分级	生产企业	浓度/ (μg·mL^-1)	RGR/ %	分级
A	300	20.9	4	G	300	21.5	4
	150	26.7	4		150	19.8	4
	75	27.6	4		75	19.9	4
	37.5	60.4	2		37.5	70.0	2
B	300	24.7	4	H	300	22.3	4
	150	25.7	4		150	22.8	4
	75	32.9	3		75	21.1	4
	37.5	74.5	2		37.5	70.3	2
C	300	26.3	4	I	300	18.7	4
	150	25.3	4		150	24.9	4
	75	32.0	3		75	27.9	4
	37.5	71.5	2		37.5	85.7	1
D	300	22.1	4	J	300	20.0	4
	150	21.4	4		150	24.5	4
	75	23.7	4		75	33.2	3
	37.5	68.3	2		37.5	61.9	2
E	300	22.7	4	K	300	19.3	4
	150	20.7	4		150	20.5	4
	75	20.2	4		75	30.4	3
	37.5	67.5	2		37.5	66.4	2
F	300	22.3	4	L	300	21.9	4
	150	24.1	4		150	24.6	4
	75	22.8	4		75	25.4	4
	37.5	69.5	2		37.5	70.4	2

表3 注射用兰索拉唑细胞毒性评级结果

Tab.3 Grade of cytotoxicity test on lansoprazole for injection n=6

2.4 聚类分析结果

将溶血积分、肌肉刺激积分、37.5 μg·mL^-1细胞毒性分级作为变量,用于聚类分析,对12家生产企业的12批样品进行系统聚类分析,结果见图1。12家生产企业可以分为3类,生产企业K为一类,A、C、D、E、F、I为一类,B、G、H、J、L为一类。

图1 12批注射用兰索拉唑的聚类分析图

Fig.1 Cluster analysis diagram of 12 batches of lansoprazole for injection

3 讨论

聚类分析是对样品进行分类的一种多元统计学方法,所谓 “类”就是相似样品的集合。通过对反映样品性质的各种变量分析处理,按照样品在性质上的亲疏、相似程度给出合理的分类。聚类分析的方法很多,笔者采用系统聚类法。其原理为:开始时每个样品自成一类,然后将最相似的两类合并,合并后重新计算新类与其他类的相似性,这一过程一直继续,直到所有样品归为一类为止^[6,7,8,9]。

药品安全性评价不同于常规检验,更重要在于采取适宜的方法对同品种安全性进行比较,选取尽可能多的量值共同作为指标,才能反映药品的整体相似程度。本实验采用聚类分析方法,对12批注射用兰索拉唑3项安全性检验项目进行分析。结果表明,12家生产企业可以分为3类,生产企业K为一类,A、C、D、E、F、I为一类,B、G、H、J、L为一类,提示12家生产企业注射用兰索拉唑安全性存在较大差异,可能与该产品的原辅料、生产工艺、储存等诸多因素有关。

本实验首次利用聚类分析方法从药品安全性实验数据中分析出不同企业产品的差异性,有助于药品监管部门更好地了解该品种的总体安全状况,同时有助于对生产企业提出进一步改进生产工艺的针对性建议,为药物安全用药提供理论依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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[1]	唐丽英,党晓伟,郝金利.浅析兰索拉唑临床应用中的问题[J].中国医药指南,2012,10(15):112-113. 兰索拉唑为质子泵抑制剂,在体内主要经细胞色素P450 酶系代谢,酶在不同人群中的差异造成其体内代谢的个体差异,因而在临床应用中就需考虑其个体差异以及药物相互作用.本文通过分析兰索拉唑的药动学研究进展,旨在找出兰索拉唑在临床中应注意的问题,为其临床合理使用提供依据. DOI:10.3969/j.issn.1671-8194.2012.15.067 URL [本文引用:1]
[2]	何晓静,陈光,丁晓飞,等.注射用兰索拉唑的安全性评价[J].广东药学院学报,2005,21(2):163-166. 目的评价国产注射用兰索拉唑的安全性。方法将注射用兰索拉唑配成适当浓度,观察豚鼠静脉注射后有无过敏反应、家兔静脉注射有无血管刺激性及热原反应、体外溶血试验中是否具有溶血和血球凝集作用,小鼠静脉注射的急性毒性。结果豚鼠静脉注射兰索拉唑无过敏反应,家兔静脉注射兰索拉唑无血管刺激性及热原反应,体外溶血试验无溶血和血球凝集作用,小鼠静脉给药的LD50及95%的可信限为163. 8mg/kg和150. 7~178. 0mg/kg。结论该药可供静脉注射试用给药。 DOI:10.3969/j.issn.1006-8783.2005.02.021 URL [本文引用:1]
[3]	国家食品药品监督管理总局.药物安全药理学研究技术指导原则[Z].2014. [本文引用:2]
[4]	国家食品药品监督管理总局.国家药包材标准YBB-00032003—2015溶血检查法[S].2015. [本文引用:1]
[5]	中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.GB/T14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分:生物学实验方法[S].北京:中国标准出版社,2005. [本文引用:1]
[6]	徐万魁,隋晓播,刘知音.氟康唑胶囊生产质量风险的聚类分析[J].中国药业,2013,22(10):8-10. [本文引用:1]
[7]	杜闻杉,刘喜纲,刘翠哲.市售一清颗粒中蒽醌含量的比较及聚类分析[J].中国药房,2016,27(15):2090-2094. [本文引用:1]
[8]	周燕,薛磊冰,奕水明,等.小通草及其伪品的近红外一致性检验和聚类分析方法研究[J].中国现代应用药学,2017,34(5):697-699. [本文引用:1]
[9]	李睿,曹玲,王玉,等.基于因子分析的茵栀黄注射液质量评价[J].上海医药,2011,32(9):449-453. 目的:分析茵栀黄注射液的评价性抽验结果,对该品种进行总体质量评价。方法:采用因子分析方法对110批茵栀黄注射液的评价性抽验定量检测结果进行统计分析,并将公共因子得分做聚类分析。结果:12个原始变量通过因子分析提取出4个公共因子,分别解释为主药成分因子、杂质和残留物因子以及辅料因子。4个公共因子的得分大小反映各批号产品的主药成分、杂质残留和辅料等方面的质量情况。因子得分的聚类结果表明,茵栀黄注射液的质量与原材料来源和工艺相关。结论:因子分析作为一种降维统计方法,适用于以大量定量数据为基础的药品质量综合评价分析。 DOI:10.3969/j.issn.1006-1533.2011.09.012 URL [本文引用:1]

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... 兰索拉唑为质子泵抑制药,通过抑制H⁺-K⁺-ATP酶的活性抑制胃酸分泌,临床用于胃及十二指肠溃疡、反流性食道炎、胃泌素瘤等的治疗^[1].注射用兰索拉唑是2016年国家评价性抽验的品种,注射药物的安全性评价是药物临床实验的一个重要组成部分.目前,国内外对注射用兰索拉唑的安全性研究主要由体外溶血实验、家兔肌肉刺激性实验、细胞毒性实验等组成^[2],但尚不能全面反映注射用兰索拉唑的总体安全状况以及作为整体安全性评价手段.笔者结合药品安全性检验的特点,通过溶血实验、肌肉刺激性实验、细胞毒性实验3项变量对12家生产企业共12批注射用兰索拉唑进行聚类分析,比较注射用兰索拉唑不同生产企业安全性差异,这是在药品安全评价过程尝试用聚类分析的方法对生产企业进行分类,为药物安全用药提供理论依据. ...

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