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美国《化学文摘》《国际药学文摘》
《乌利希期刊指南》
WHO《西太平洋地区医学索引》来源期刊
日本科学技术振兴机构数据库（JST）
第七届湖北十大名刊提名奖
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第七届湖北十大名刊提名奖
, 洪峰, 周荣苹, 邵姣
, HONG Feng, ZHOU Rongping, SHAO Jiao,
目的 解决光热试剂——IR780难溶于水而导致细胞摄取效率低,进而影响光热治疗效果的问题。方法 通过溴化十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethyl ammonium bromide,CTAB)模板法合成介孔二氧化硅纳米颗粒,然后装载IR780。最后与肿瘤细胞孵育并观察IR780进入细胞的情况和光热治疗效果。结果 IR780经过介孔二氧化硅纳米颗粒包覆以后可明显提高其水溶性,进而增加肿瘤细胞的摄取量,同时对光热治疗效果也有明显的增强。结论 所制得的介孔二氧化硅纳米递药系统可以明显提高IR780的摄取效率和对肿瘤细胞的光热治疗效果。
Objective Photothermal reagent (IR780) is insoluble in water,which leads to low cellular uptake efficiency and limits the effect of photothermal therapy. This study aims to solve this problem. Methods The mesoporous silica nanoparticles were synthesized by Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) template method and then loaded with IR780. Finally they ware incubated with tumor cells. IR780 entering into cells was observed. Photothermal therapy efficacy was observed. Results Water solubility of IR780 was significantly increased after it was modified with mesoporous silica nano particles. And the uptake of IR780 by tumor cells was significantly increased,then the effect of photothermal killing was also significantly enhanced. Conclusion The mesoporous silica nano-drug delivery system can significantly improve the uptake efficiency of IR780 and the photothermal therapy on tumor cells.
恶性肿瘤是目前临床医学面临的重要挑战,恶性肿瘤的治愈也已成为世界范围内仍未解决的重大医学难题。目前临床上常用的方法是药物化疗、放射治疗和手术切除三种方法,但是化疗和放疗具有较强的毒副作用,而手术切除又常常容易导致肿瘤复发[1,2,3]。光热治疗(PTT)是将光能转化为热能,加热肿瘤病灶部位使温度达到临界治疗温度并维持一段时间,以杀死肿瘤细胞,从而达到治疗肿瘤的目的[4,5,6]。光热治疗具有创伤小、不良反应少以及高选择性等优点,因而逐渐得到临床医学的肯定。IR-780碘化物是一种脂溶性的花青素染料,由于其具有强荧光性,已被认为是很好的肿瘤活体成像的荧光探针[7]。此外,由于IR-780在组织穿透性好的近红外区有较强的吸收特性并能够高效地将其转化为热能[8,9,10],故成为了肿瘤治疗中的一种理想光热治疗剂。但由于IR780为难溶于水的小分子试剂,难以被细胞摄取,同时其体内的稳定性较差,易被机体清除,最终严重影响IR780对肿瘤细胞的标记和光热杀伤效率[11,12,13]。因此,为了提高IR780的细胞摄取量和在细胞中的稳定性,以最终提高对肿瘤细胞的光热杀伤效果,本实验拟通过十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethyl ammonium bromide,CTAB)模板法合成球形的介孔二氧化硅纳米颗粒,然后将光热试剂IR780吸附进入纳米颗粒的介孔中[14,15,16],以期增加IR780的水溶性来提高细胞摄取量和在肿瘤细胞中的稳定性,最终提高对肿瘤细胞的光热杀伤效果。
CJJ78-1型磁力加热搅拌器(巩义予华仪器有限公司);MDL-H-808型808 nm激光器(长春新产业光电公司);TC16-WS型台式离心机(湖南湘仪仪器有限公司);Synergy HT型酶标仪(美国Thermo公司);Philips CM12型透射电子显微镜(日本电子光学公司);UV-2450型紫外可见分光光度计(日本岛津公司);Zeta Pals型高分辨zeta电位及激光粒度分析仪(美国布鲁克海文仪器公司);1300型生物安全柜(美国Thermo公司);311型二氧化碳细胞培养箱(美国Thermo公司);IX70型荧光显微镜(Olympus公司);XL/XL-MCL型流式细胞仪(美国BD公司)。
CTAB(含量≥98%,美国Sigma公司);正硅酸乙酯(TEOS,含量≥98%,美国Sigma公司);氢氧化钠(分析纯,北京华威锐科化工);无水乙醇(分析纯,天津市元立化工);氯化钠(分析纯,天津市元立化工);IR780(含量≥99%,美国Sigma公司);DMSO(生化级,美国Sigma公司);噻唑蓝(MTT,含量≥95%,美国Sigma公司);黑色素瘤(B16)细胞购自美国ATCC;细胞DMEM培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(美国Gibco公司);胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25%:0.02%,美国Gibco公司);青霉素-链霉素(PS,美国Gibco公司);4 %多聚甲醛(TCI试剂公司);DAPI(德国Invitrogen公司)。水为超纯水,其他试剂均为分析纯。
称取CTAB0.1 g溶解于去离子水20 mL中,将其加热至60 ℃,使CTAB完全溶解,加入乙醇3 mL和2 mol·L-1氢氧化钠溶液150 μL。将烧瓶连接至加热磁力搅拌器上,1000 r·min-1(
将10 mg IR-780和40 mg所制备的介孔二氧化硅纳米颗粒(mSiO2)加入到二甲亚砜(DMSO)5 mL中,在室温下避光搅拌24 h。用10 000 r·min-1(
将待测样品配制适当浓度的溶液,然后滴加少量(约10 μL)于电镜观察制样用超薄碳膜铜网或镍网上,在室温下静置至溶剂挥发干,置于透射电镜样品槽内并采用低倍透射电镜(TEM)对样品的形貌和尺寸进行观察并摄影。结果见
图1 2种SiO2纳米颗粒的透射电镜图 A.mSiO2纳米颗粒;B.IR780@mSiO2纳米颗粒
Fig.1 TEM images of two kinds of mSiO2 nanoparticles A.mesoporous SiO2 nanoparticles;B.IR780@m SiO2 nanoparticles
结果显示,IR780附载的mSiO2纳米颗粒均呈球形,分散性较好,表面存在大量的介孔,纳米孔径约2 nm。IR780@mSiO2纳米颗粒的直径约100 nm。
取适量IR780@mSiO2粉末均匀分散于2 mL水中,将溶液置于样品槽中,采用粒度仪对纳米颗粒进行粒径测试,IR780@mSiO2纳米颗粒的粒径分布见
图2 IR780@mSiO2纳米颗粒的粒径分布
Fig.2 Distribution of particle size of IR780@mSiO2 nanoparticles
通过动态光衍射法测得的粒度分布结果与“2.3”项下结果基本一致。IR780@mSiO2纳米颗粒的粒径约103 nm,粒度分布较窄,说明纳米颗粒的大小比较均匀。
将处于对数生长期的B16细胞用DMEM细胞培养基均匀分散成密度约为1×105个·mL-1的细胞悬液,在96孔板中每孔加入100 μL,约1×104个细胞,将96孔板置于含5 % CO2的无菌细胞培养箱中培养12 h;分别配置一系列不同浓度(0.0016,0.008,0.04,0.2,1 mg·mL-1)IR780和IR780@mSiO2的DMEM溶液,置换96孔板中旧的细胞培养基,在细胞培养箱中继续培养24 h;在各个孔中加入5 mg·mL-1MTT母液约20 μL,继续培养4 h;取出细胞培养基,每孔加入细胞实验用DMSO约100 μL,放于37 ℃摇床中避光低速震荡10 min;取出96孔板,将其置于酶标仪中测试各个孔在570 nm处的吸光度值。并与对照组细胞相比,计算出细胞存活率。
通过MTT实验测试IR780@mSiO2纳米颗粒的细胞安全性性能。如
为了研究IR780装载mSiO2前后的细胞摄取效果,笔者采用荧光显微镜观察处理后黑色素瘤(B16)细胞的成像效果。将处于对数生长期的B16细胞用DMEM细胞培养基均匀分散成密度约为1×106个细胞·mL-1的细胞悬液,在24孔板中每孔加入100 μL,1×105个细胞,将24孔板置于含5 % CO2的无菌细胞培养箱中培养12 h;在不同的实验组细胞中分别加入等量的游离IR780和IR780@mSiO2纳米颗粒,继续培养4 h;吸去培养基,将细胞用冷的PBS洗涤3次,然后每孔加入PBS 300 μL。置于荧光倒置显微镜下观察IR780和DAPI的分布情况,并拍照。其中IR780用波长555 nm的绿光激发,DAPI用波长405 nm的紫外光激发。见
图4 IR780@mSiO2纳米颗粒的细胞摄取效果 A.游离IR780;B.IR780@mSiO2纳米颗粒
Fig.4 Cell uptake of IR780@mSiO2 nanoparticles A.free IR780;B.IR780@mSiO2 nanoparticles
为了监测细胞摄取和荧光成像性能,将B16细胞与0.2 mg·mL-1的不同的样品一起孵育。在游离IR780组中,B16细胞显示出较弱的红色IR780荧光,这意味着其细胞摄取效率较低(
将等质量的mSiO2纳米颗粒、游离IR780和IR780@mSiO2纳米颗粒,加入含有B16细胞的96孔板中,继续培养4 h;吸去培养基,将细胞用PBS洗涤3次,然后每孔加入300 μL的DMEM细胞培养基。用2 W·(cm2)-1808 nm激光照射10 min,再继续培养2 h。最后用MTT法测定细胞的活力。并与对照组细胞相比,计算出细胞的光热杀伤效率。
当0.2 mg·mL-1的单纯mSiO2纳米颗粒与癌细胞孵育并给予近红外光照射后,细胞的死亡率不到3%,这就排除了mSiO2纳米颗粒和808 nm近红外光会对细胞造成杀伤的可能。当0.2 mg·mL-1游离IR780与肿瘤细胞孵育并给予近红外光照射后,细胞的杀伤效率达到25%,说明IR780可以在808 nm近红外光照射下具有一定的肿瘤细胞杀伤能力,但是效率较低。然而,当0.2 mg·mL-1 IR780@mSiO2纳米颗粒与肿瘤细胞孵育并给予近红外光照射后,细胞的杀伤效率达到98%,说明IR780@mSiO2纳米颗粒可以在808 nm近红外光照射下明显增加肿瘤细胞的杀伤效率。这些结果表明,IR780在mSiO2纳米颗粒的帮助下可以明显提高其进入肿瘤细胞的量和稳定性,进而在808 nm近红外光照射下,明显提高对肿瘤细胞的光热杀伤效果。因此,制备的介孔二氧化硅纳米药物递送系统可以明显的提高药物的细胞摄取量,进而更好地发挥药物的治疗效果。
由于IR780在水中不溶,因此将其开发成研究用或者临床用药剂的难点就是改善它的溶解性[17]。为此,笔者制备了水溶性较好的mSiO2纳米递药系统。然后将光热试剂IR780载入mSiO2纳米递药系统中,通过一系列理化表征,细胞实验证明该IR780装载的mSiO2纳米颗粒具有较好的分散性和形貌。同时通过MTT实验可知该系统具有较好的细胞安全性。细胞内吞结果也显示,通过将疏水性的IR780装载进入水溶性介孔二氧化硅纳米颗粒来提高其水溶性后,可明显增加IR780在肿瘤细胞中的摄取效率。最后的光热杀伤实验还证明,该系统可有效提高IR780的细胞杀伤效率,使其达到98%,明显高于相同浓度游离IR780的25%。因此,笔者制备的这种新型纳米载药系统可以帮助难溶于水的药物进入肿瘤细胞,从而发挥更好的治疗效果。
本研究中制备的光热剂——IR780转载的IR780@mSiO2具有荧光性能也具有光热性能[18,19]。因此,在临床上,其可通过静脉注射后,药物在体内借助纳米颗粒递药系统在肿瘤微环境的EPR被动靶向效应下使药物到达肿瘤病灶部位,然后根据其荧光和光热性能实现肿瘤的诊断和治疗双重功能[20],从而实现一次给药便能实现先诊断,然后观察IR780荧光聚集部位判断是否有肿瘤,在此基础上再用近红外光进行选择性照射而达到治疗肿瘤的目的。因此,IR780@mSiO2可以有效的将肿瘤的诊断和治疗合二为一,实现肿瘤的诊疗一体化。这种二氧化硅纳米递送系统还具有抗癌效应的靶向性,减少了药用剂量,降低毒副作用等优势[20,21,22]。除此之外,二氧化硅表面还易于进行各种靶向性修饰,比如叶酸靶向,RGD靶向等修饰,以提高肿瘤细胞的主动靶向性[23]。但是本研究目前只是在体外进行,后续还需要做大量的动物实验和临床预期实验,才能真正用于临床治疗。笔者的工作为药物递送,特别是难溶于水的药物靶向递送,提供了一个思路和工具,以期通过这种递药系统让更多的药物更好地用于临床。
The authors have declared that no competing interests exist.
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DOI:10.1021/nn203165z
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Targeted uptake of therapeutic nanoparticles in a cell-, tissue-, or disease-specific manner represents a potentially powerful technology. Using prostate cancer as a model, we report docetaxel (Dtxl)-encapsulated nanoparticles formulated with biocompatible and biodegradable poly(D,L-lactic-co-glycolic acid)-block-poly(ethylene glycol) (PLGA-b-PEG) copolymer and surface functionalized with the A10 2'-fluoropyrimidine RNA aptamers that recognize the extracellular domain of the prostate-specific membrane antigen (PSMA), a well characterized antigen expressed on the surface of prostate cancer cells. These Dtxl-encapsulated nanoparticleaptamer bioconjugates (Dtxl-NP-Apt) bind to the PSMA protein expressed on the surface of LNCaP prostate epithelial cells and get taken up by these cells resulting in significantly enhanced in vitro cellular toxicity as compared with nontargeted nanoparticles that lack the PSMA aptamer (Dtxl-NP) (P < 0.0004). The Dtxl-NP-Apt bioconjugates also exhibit remarkable efficacy and reduced toxicity as measured by mean body weight loss (BWL) in vivo [body weight loss of 7.7 ± 4% vs. 18 ± 5% for Dtxl-NP-Apt vs. Dtxl-NP at nadir, respectively (mean ± SD); n = 7]. After a single intratumoral injection of Dtxl-NP-Apt bioconjugates, complete tumor reduction was observed in five of seven LNCaP xenograft nude mice (initial tumor volume of ≈300 mm06), and 100% of these animals survived our 109-day study. In contrast, two of seven mice in the DtxI-NP group had complete tumor reduction with 109-day survivability of only 57%. Dtxl alone had a survivability of only 14%. Saline and nanoparticles without drug were similarly nonefficacious. This report demonstrates the potential utility of nanoparticle-aptamer bioconjugates for a therapeutic application.
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DOI:10.1021/nn102722z
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DOI:10.1002/jps.23356
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DOI:10.1021/am5004393
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纳米给药系统指粒径为10～100 nm的微粒分散体系,具有体内较长循环时间、肿瘤靶向、易被细胞摄取、调节药物释放、改善药物溶解度、增加药物稳定性等特点。该文对纳米给药系统的肿瘤靶向机制及临床应用进展进行综述,以期为抗肿瘤药物纳米给药系统的深入研究提供参考。
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神经退行性疾病是一类慢性进行性神经疾病,由于血-脑屏障的存在,治疗药物入脑有一定困难。纳米药物递释系统可以提高药物的体内稳定性,实现靶向递药,增加药物在脑部的富集,经配体修饰后可进一步靶向于局部病灶,从而提高疗效。纳米递药载体对于神经退行性疾病的治疗有重要的研究意义和应用前景。
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目的：制备具有近红外荧光的纳米二氧化钛（TiO2）,并考察纳米粒的载药及体外释放性能。方法通过水热法合成掺杂钐的 TiO2（Sm-TiO2）,采用透射电镜（TEM）对其进行表征,测定其荧光光谱,并考察对多柔比星（DOX）的载药量及体外释放曲线。结果所制备的纳米粒分散均匀,外观呈梭状,长度100-200 nm,发射波长640-670 nm,在水中的载药量达11.5%,体外释放具有 pH 敏感性。结论所制备 Sm-TiO2有良好的近红外荧光发光效果、较高的载药量及可控的体外释放,可以作为新型药物载体深入研究。
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目的 将塞来昔布制备成自微乳化释药系统（SMEDDS）以增加药物的溶出速度,并提高药物在大鼠体内的生物利用度。方法 采用伪三元相图法确定了塞来昔布-SMEDDS的最优处方,并评价了其经水稀释后形成的微乳外观、微观形态、粒径分布及体外释放行为;以塞来昔布混悬液为对照,测定塞来昔布-SMEDDS经大鼠口服的生物利用度。结果 塞来昔布-SMEDDS处方组成为：中链三酰甘油（油相）,聚山梨酯-20（乳化剂）,二乙二醇单乙基醚（助乳化剂）,最佳配比为2∶9∶9。塞来昔布-SMEDDS经水稀释后形成的微乳外观呈淡蓝色透明状液体;透射电镜下显示其大小均匀,呈圆整球状分布,平均粒径为（57.6±14.2）nm;SMEDDS显著提高了塞来昔布的体外溶出速度;塞来昔布-SMEDDS和塞来昔布混悬液的药物浓度-时间曲线下面积分别为（5.54±0.94）和（3.32±0.59）mg·L-1·h,相对生物利用度为166.9%。结论 将塞来昔布制备成SMEDDS可显著提高药物的体外溶出速度和体内生物利用度。
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DOI:10.1038/srep27421
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目的比较曲安奈德（TAA）纳米脂质组装体（TAA-LPPs）、TAA乙醇脂质体（TAA-Ethosomes）的体外透皮特性。方法制备TAA-LPPs和TAA-Ethosomes,采用透射电镜观察其形态,激光粒度仪测定其粒径分布,改良Franz单室扩散池进行离体大鼠皮肤渗透实验,测定两种曲安奈德脂质载体的累积透过量及在皮肤内的滞留量。结果 TAALPPs和TAA-Ethosomes均呈球形或类球形,平均粒径分别为（99.9±1.3）和（105±1.4）nm。TAA-LPPs、TAA-Ethosomes和TAA-混悬液的累积透过量分别为（53.59±4.40）,（87.03±4.87）,（30.54±8.61）μg·（cm^2）^-1,32 h后皮肤内药物滞留分别为（1.02±0.13）,（0.62±0.08）,（0.55±0.17）μg·（cm^2）^-1。结论与TAA-Ethosomes比较,TAA-LPPs更利于曲安奈德经皮局部给药,减少药物全身吸收。
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纳米医学是纳米技术的分支，其将纳米技术的原理与方法应用于医学。纳米粒子独特的尺寸使其具有独特和优良的材料特性。纳米粒子以最小的侵袭性进行药物递送，提高了药物治疗的靶向性。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，全球范围内发病率正逐年攀升。传统的治疗方法虽有效，但存在诸多不足。近年来纳米药物的快速发展，为解决这些难题提供了新的思路与方案。纳米载药系统种类繁多，包括脂质体、聚合物、抗体、金属、磁性物质、碳、陶等多种有机或无机材料。纳米药物的靶向策略包括被动靶向和主动靶向等，均可增强药物在肿瘤部位的蓄积。特定的纳米粒子也可直接杀伤肿瘤细胞。随着纳米药物的快速发展，其在乳腺癌的临床应用也日趋广泛，已有多种纳米药物进入临床研究或上市。
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