德国Thermo Fisher UltiMate 3000系列高效液相色谱仪(包括LPG-3400SDN四元梯度泵,WPS-3000SL自动进样器,TCC-3000RS柱温箱,VWD-3100检测器,DAD-3000检测器);Sepax HP C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);Agilent SB Aq C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);Waters T3色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);纯水机(ELGA PURELAB Classic,超纯水系统);电子分析天平(Sartorius SQP QUINTIX125D-1CN,感量0.01 mg);超声提取器(SK8200HP,上海科导有限公司)。

地肤子皂苷Ic对照品(中国食品药品检定研究院,含量83.6%,批号:111723-201404);硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂分厂);乙腈(美国Fisher公司,Lot:172009);磷酸、乙酸为色谱纯,水为超纯水,其他试剂为分析纯;地肤子饮片(湖北正光九资河药业有限公司,批号:160101,经中国医学科学院药用植物研究所郭宝林教授鉴定);10批地肤子配方颗粒(样品批号:P20161023、P20161025、P20161027、P20161029、P20161030、P20161101、P20161102、P20161103、P20161105、P20161109,由劲牌生物医药有限公司提供,规格:每袋1.5 g)。

取地肤子配方颗粒粉末1 g,共3批,加甲醇10 mL,超声处理30 min ,滤过,滤液作为供试品溶液。另取地肤子皂苷Ic对照品,加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)实验,吸取上述两种溶液各5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(16:9:2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的紫红色斑点,结果见图1。

2.2.1 水分测定 分别取10批地肤子配方颗粒样品粉末(过孔径850 μm筛)约2 g,精密称定,参照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0832项下水分测定法第一法进行测定。地肤子配方颗粒水分测定结果为5.78%~6.50%(表1),水分平均含量为6.06%,符合《中华人民共和国药典》2015年版四部颗粒剂项下水分要求。

2.2.2 粒度测定 取地肤子配方颗粒样品10批,参照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0982第二法双筛分法测定,结果见表1,10批地肤子配方颗粒的粒度均小于15%,符合《中华人民共和国药典》2015年版四部颗粒剂项下粒度要求。

2.2.3 溶化性测定 分别取供试品10 g,加入热水200 mL,搅拌5 min ,立即观察,清澈无异物或焦屑,说明10批地肤子颗粒剂的溶化性符合要求。

2.2.4 装量差异检查 取地肤子配方颗粒样品10批,参照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0104颗粒剂项下单剂量包装的颗粒剂装量差异方法检查,结果见表1,10批地肤子配方颗粒的装量差异限度均在±8%(每袋1.5 g)范围内,符合装量差异要求。

2.2.5 微生物限度检查 按照非无菌产品微生物限度检查,结果见表2,均符合要求:菌落总数≤1000 CFU·g^-1;真菌及酵母菌≤100 CFU·g^-1;大肠埃希菌不得检出(1 g)。

分别取10批地肤子配方颗粒样品粉末(过孔径850 μm筛)约2 g,精密称定,按《中华人民共和国药典》2015年版四部通则2201项下的热浸法进行测定,用乙醇为溶剂,测得浸出物含量为27.44%~30.95%,平均28.85%。

2.4.1 对照品溶液的制备 取地肤子皂苷Ic对照品适量,精密称定,加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液,即得。

2.4.2 供试品溶液的制备 取本品粉末约0.1 g,精密称定,加70%甲醇定容至10 mL,放置过夜,超声使其溶解后混匀,用直径0.22 μm针头过滤器滤过,即得。

2.4.3 色谱条件与系统适用性实验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-1.3%醋酸溶液(85:15)为流动相;蒸发光散射检测器检测,漂移管温度100 ℃,载气流速2.5 L·min^-1。理论板数按地肤子皂苷Ic峰计算应不低于3000。

2.4.4 专属性实验 取对照品溶液及供试品溶液,按上述色谱条件进行分析。见图2,结果表明,供试品溶液与对照品溶液在相同的保留时间上都有色谱峰。

2.4.5 线性关系考察 精密称取对照品地肤子皂苷Ic17.96 mg,加甲醇溶解并定容至25 mL,摇匀,得浓度为600.5824 mg·L^-1对照品储备液,取对照品储备液5 mL,加甲醇定容至10 mL,得浓度为300.291 2 mg·L^-1的溶液。将该溶液稀释2倍,以后浓度均以上一高浓度为母液次递稀释2倍,即得不同浓度的对照品溶液。在上述色谱条件下进行色谱分析,得到各浓度色谱峰的峰面积,以色谱峰面积(A)的对数为横坐标,相对应浓度的对数(C)为纵坐标建立标准曲线为:Y=0.660 48X+1.480 20,R²=0.999 5,结果表明地肤子皂苷Ic在18.768 2~600.582 4 mg·L^-1呈良好的线性关系。

2.4.6 精密度实验 取“2.4.5”项中300.291 2 mg·L^-1的对照品溶液作为精密度实验的供试品溶液。取该溶液在上述色谱条件下连续进样分析6次,得到各次分析时地肤子皂苷Ic的含量,计算得到地肤子皂苷Ic精密度实验的RSD为0.84%。结果表明仪器的精密度良好。

2.4.7 稳定性实验 取“2.4.5”项中300.291 2 mg·L^-1的对照品溶液作为稳定性实验的供试品溶液,按上述色谱条件,分别于1,1.5,2,2.5,4,7 h进样,得到各时间对照品的峰面积,根据标准曲线计算地肤子皂苷Ic含量并计算RSD值,得地肤子皂苷Ic稳定性实验的RSD为2.24%。结果表明地肤子皂苷Ic在7 h内稳定。

2.4.8 重复性实验 取同一批号配方颗粒(P20161023),按“2.4.2” 项方法制备供试品溶液6份,分别测定地肤子皂苷Ic的峰面积并计算含量,见表3。地肤子皂苷Ic的平均含量为0.978 6%,RSD值为0.90%。结果表明该方法的重复性良好。

2.4.9 加样回收实验 取已知含量的同一批样品(P20161023)9份,精密称定,分别精密加入各对照品溶液适量,按“2.4.2 ”项方法,制备供试品溶液,进样测定,见表4。地肤子配方颗粒中添加地肤子皂苷Ic的回收率为102.04%,RSD值为0.98%。结果表明该方法准确可靠。

2.4.10 样品含量测定 分别取10批地肤子配方颗粒,按照上述含量测定方法操作,计算每批样品中地肤子皂苷Ic的含量,见表5。结果表明10批样品含量稳定,地肤子皂苷Ic含量测定数据为0.97%~0.99%,根据测定结果,结合生产数据,暂定本品按干燥品计算,含地肤子皂苷Ic不得少于0.20%。

2.5.1 色谱条件与系统适应性实验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相,按表6中的规定进行梯度洗脱;检测波长为210 nm。理论板数按地肤子皂苷Ic峰计算应不低于3000。

2.5.2 对照品溶液的制备 取地肤子皂苷Ic对照品适量,精密称定,加甲醇制成每毫升含地肤子皂苷Ic 0.5 mg的溶液,即得。

2.5.3 供试品溶液的制备 取本品粉末约0.1 g,精密称定,加20%甲醇定容至10 mL,超声溶解后混匀,用孔径0.22 μm针头过滤器滤过,即得。

2.5.4 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL,注入液相色谱仪,测定,即得。

2.5.5 系统耐用性实验 取同一样品分别采用同一台Thermo Fisher UltiMate 3000系列高效液相色谱仪、相同的色谱分析条件,不同的色谱柱对同一样品进行色谱分析。分析用的色谱柱如下:Sepax HP C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、A gilent SB Aq C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Waters T3色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。结果各色谱柱分离效果均较好,表明方法具有良好的系统耐用性。

2.5.6 专属性实验 取对照品溶液及供试品溶液,按上述色谱条件进行分析。见图3。结果表明,供试品溶液与对照品溶液在相同的保留时间上都有色谱峰。

2.5.7 精密度实验 取同一供试品溶液连续进样6次。其指纹图谱及相似度计算结果相似度系数>0.99,符合指纹图谱技术要求(≥0.95),其结果表明仪器精密度良好。

2.5.8 稳定性实验 取同一样品溶液分别在1.5,5,9,17,25,33 h进样,其考察图谱及相似度计算结果相似度系数>0.96,符合指纹图谱技术要求(≥0.95)。结果表明33 h内测定,样品溶液稳定。

2.5.9 重复性实验 取同一批号的地肤子配方颗粒,按供试液制备方法及检测方法操作6次,其指纹图谱及相似度计算结果相似度系数在0.96以上,符合指纹图谱技术要求(不小于0.95)。其结果表明方法重复性较好。

2.5.10 样品检测 对收集的10批地肤子配方颗粒样品进行了指纹图谱考察,图谱见图4,5。结果表明10批样品均能检出地肤子皂苷Ic,且相似度良好(表7,相似度系数>0.95)。