目的 建立丹参脂溶性成分丹参酮Ⅰ、丹参酮 ⅡA及隐丹参酮高效液相色谱(HPLC) 同步测定方法,并考察其体外溶出行为。方法 选用 Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱,以乙腈-水(含0.1%甲酸)为流动相梯度洗脱,同时测定丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA及隐丹参酮含量,考察十二烷基硫酸钠(SDS)浓度、溶出液pH值和溶出仪转速对3种成分溶出行为的影响。结果 丹参酮Ⅰ回归方程为
Objective To establish a method of simultaneous determination of tanshinoneⅠ,tanshinonⅡA and cryptotanshinone, three liposoluble constitue of salvia miltiorrhiza and investigate of its dissolution behavior
戴安高效液相色谱仪(美国,Dionex UltiMate3000,包括四元高压液相泵、自动进样器、紫外检测器);色谱软件(戴安液相层析仪软件Chromeleon 7.1);电子天平(德国 Sartorius,型号:BS 224S,感量:0.01 mg);离心机(上海安亭科学仪器厂,型号:TGL-16G);超声清洗器(天津市奥特赛斯仪器有限公司,型号:AS5150BD);纯水仪(优普超纯科技公司,型号:UPT);电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司,型号:DHG-9013A);溶出仪(天津市国铭医药设备有限公司,型号:RC-6)。
丹参酮Ⅰ对照品(中国食品药品检定研究院,含量:99.0%,批号:110867-201607);丹参酮ⅡA对照品(中国食品药品检定研究院,含量:99.0%,批号:110766-201520);隐丹参酮对照品(中国食品药品检定研究院,含量:99.0%,批号:110852-200806);丹参提取物(陕西慈缘生物技术有限公司,批号:20140401,20140402,20140413);十二烷基硫酸钠(SDS,成都市科龙化工试剂厂,分析纯);磷酸二氢钾(成都市科龙化工试剂厂,分析纯);甲醇(迪马公司,色谱纯);乙腈(迪马公司,色谱纯);无水甲酸(天津市科密欧化学试剂有限公司,色谱纯);其他试剂为分析纯,水为超纯水。
采用Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱;流动相:A(0.1%甲酸),B(乙腈),采用梯度洗脱,洗脱顺序为:0~30 min,5%→55% B;>30~40 min,55%→75% B;>40~50 min,75% B;>50~55 min,75%→5% B;流速1.0 mL·min-1;检测波长286 nm;柱温30 ℃;进样体积10 μL。
分别精密称取干燥至恒重的各对照品适量于5 mL棕色量瓶,甲醇定容,得到贮备液备用。取各储备液适量于25 mL量瓶,甲醇定容得到各对照品的混合标准溶液,其中各对照品浓度分别为丹参酮Ⅰ93.00 μg· mL-1,丹参酮ⅡA 82.50 μg· mL-1,隐丹参酮57.50 μg· mL-1,冷藏、避光备用。
精密称取一定量丹参提取物至10 mL 量瓶内,加入一定量甲醇,超声使其完全溶解,10 000 r·min-1(
2.4.1 方法专属性考察 按“2.1”项色谱条件,分别取空白甲醇溶液、对照品溶液和供试品溶液,记录色谱图(
2.4.2 线性关系考察 取“2.2”项配制的混合标准溶液,用甲醇依次稀释,得以下混合标准品的标准曲线溶液:丹参酮Ⅰ标准曲线浓度为93.00,46.50,23.25,11.63,5.81,2.91,1.45 μg· mL-1,丹参酮ⅡA标准曲线浓度为82.50,41.25,20.63,10.31,5.16,2.58,1.29 μg· mL-1,隐丹参酮标准曲线浓度为57.50,28.75,14.38,7.19,3.59,1.80,0.90 μg· mL-1。 按“2.1”项色谱条件进样20 μL,以色谱峰面积(
丹参酮Ⅰ回归方程为
2.4.3 精密度实验 取高、中、低浓度混合对照品溶液,其中丹参酮Ⅰ高、中、低浓度分别为46.50,11.63,2.91 μg· mL-1,丹参酮ⅡA高中低浓度分别为41.25,10.31,2.58 μg· mL-1,隐丹参酮高、中、低浓度分别为28.75,7.19,1.80 μg· mL-1,在上述色谱条件下,连续进样5次,记录峰面积,分别计算峰面积的RSD。 结果丹参酮Ⅰ高、中、低浓度的峰积RSD分别为0.36%,0.54%,0.55%;丹参酮ⅡA高中低浓度的峰面积RSD分别为0.50%,0.14%,0.32%;隐丹参酮高中低浓度的峰面积RSD 分别为0.66%,0.28%,0.45%;说明各成分精密度良好。
2.4.4 稳定性实验 取两种浓度混合对照品溶液,其中丹参酮Ⅰ高、低浓度分别为46.50,2.91 μg· mL-1,丹参酮ⅡA高、低浓度分别为41.25,2.58 μg· mL-1,隐丹参酮高、低浓度分别为28.75,1.80 μg· mL-1,将该混合对照品溶液置于37 ℃恒温水浴锅中,于0,2,4,6,8,12,24,36 h取样,在上述色谱条件下进样,记录峰面积。结果丹参酮Ⅰ高、低浓度RSD分别为1.15%,1.02%;丹参酮ⅡA高、低浓度RSD分别为1.01%,0.66%;隐丹参酮高、低浓度RSD分别为0.65%,1.16%,可见,各成分在37 ℃下36 h稳定。
2.4.5 加样回收率实验 取已知含量的提取物,精密称定27份,分成9组,每组3份。分别加入高、中、低浓度的混合对照品溶液,其中丹参酮Ⅰ高、中、低浓度分别为46.50,11.63,2.91 μg· mL-1,丹参酮ⅡA高、中、低浓度分别为41.25,10.31,2.58 μg· mL-1,隐丹参酮高、中、低浓度分别为28.75,7.19,1.80 μg· mL-1,按“2.3”项下方法处理,在上述色谱条件下测定。结果丹参酮Ⅰ高、中、低浓度平均加样回收率为(99.85±0.034)%(
溶出条件:由于丹参脂溶性成分均为水难溶性成分,故选择《中华人民共和国药典》收载的第三法(小杯法)进行溶出实验。释放介质体积为250 mL,为纯水或不同pH值缓冲液,溶出温度为(37.0±0.5)℃,取样时间点为0,2,4,6,8,10,12 h,每次吸取溶出液3 mL,取出后及时补加新鲜空白溶出介质3 mL,溶出液以孔径0.45 μm滤膜过滤,续滤液用HPLC法进行测定。
2.6.1 SDS对丹参提取物成分溶出行为的影响 对于水溶性较差的药物,可在释放介质中加入表面活性剂促进药物溶出[5],故本实验考察了0.0%,0.3%,0.5%,0.7%和0.9% SDS对丹参脂溶性成分丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA和隐丹参酮溶出行为的影响。释放介质为pH值6.8磷酸盐缓冲液,转速75 r·min-1,实验结果见
由
2.6.2 不同pH值对丹参提取物溶出行为的影响 考察丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA和隐丹参酮在纯化水、pH值4.0、pH值6.8和pH值7.4磷酸盐缓冲液中的溶出行为。释放介质SDS浓度为0.5%、转速75 r·min-1 时实验结果见
由
2.6.3 转速的影响 由于丹参脂溶性成分均为水难溶性成分,本实验采用提高溶出仪转速的方法提高其溶出度,分别考察3种成分在50,75和100 r·min-1条件下的溶出行为,结果见
由
由于丹参3种脂溶性成分结构相似,尤其是隐丹参酮和丹参酮,所以HPLC很难将二者达到基线分离,所以本实验采用梯度洗脱的方法,最终分离度良好,成功对三者进行分析。
由于丹参脂溶性成分均为水难溶性成分,在溶出介质中浓度较低,故选择《中华人民共和国药典》2015年版收载的第三法——小杯法进行溶出实验,实验结果显示,该方法适宜作为丹参脂溶性成分溶出行为的研究。
在实验中,曾考察除SDS之外的其他表面活性剂对丹参3种脂溶性成分的溶出行为的影响,如聚山梨酯-80,结果显示聚山梨酯-80对3种成分溶出行为无影响(数据未列出),最终筛选出SDS为作为溶出介质。
本实验以丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA及隐丹参酮为丹参脂溶性成分的指标成分,成功建立了HPLC方法同时测定丹参提取物中丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA及隐丹参酮含量,考察了丹参脂溶性成分的体外溶出行为,筛选其体外溶出条件,为丹参脂溶性成分口服制剂的研究开发提供研究基础。
The authors have declared that no competing interests exist.