1.1.1 实验动物 斑马鱼AB品系,购于凯基生物有限公司,实验动物生产许可证号:SCXK(沪)2018-0004。饲养条件:昼夜节律,昼:夜=14 h:10 h;温度 (28.5 ± 0.5) ℃。饲养环境严格按照《江苏省地方标准》实验用斑马鱼饲养技术条件。实验流程严格按照《实验动物管理与使用指南》执行。

1.1.2 药品与试剂 药材饮片:当归(产地甘肃,批号:17071705),炒白芍(产地安徽,批号:17091605),川芎(产地四川,批号:17101814),菟丝子(产地内蒙古,批号:17081605),枸杞子(产地宁夏,批号:17102112)。

提取物:当归提取物(批号:CDG-A-081908),白芍提取物(批号:CBS-A-091802),川芎提取物(批号:CCX-A-081109),菟丝子提取物(批号:CTSZ-A-081118),枸杞子提取物(批号:CGQ-A-081203),以上提取物与药材质量比均为1:10,均购于陕西嘉禾生物科技股份有限公司。人参皂苷(ginsenoside,Rg1,含量≥98%,批号:B21057),邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP;含量> 99.5%,批号:S51140),链酶蛋白酶E(批号:721J041)、吖啶橙染液均购自上海源叶生物科技有限公司;MS-222(Acros Organics,批号:A0288328)。

1.1.3 实验仪器 Leica体式荧光显微镜(Leica公司,型号:M205FA);生化培养箱(上海跃进医疗器械有限公司,型号:SPX-150);酶标仪(Bio-Tek公司,型号:SyneRgy2);凝胶电泳仪(BIO-RAD公司,型号:1658033);定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)仪(Applied Biosystems公司,型号:7500)。

1.2.1 药物溶液的配制 归芍方研究用样品的制备。 ①归芍方组成:当归、炒白芍各10 g,川芎、菟丝子、枸杞子各8 g。②归芍方药材饮片水提取物(Chinese material medicine extract,ME,批号:20180523):按归芍方,加水提取2次(7倍,5倍),每次提取1.5 h,滤过,合并滤液,减压浓缩至含生药量0.1 g·mL^-1,即得。③归芍方药材水提醇沉提取物(Chinese material medicine extract alcohol precipitation treatment,MEA,批号:20180523):按归芍方,加水提取2次(7倍,5倍),每次提取1.5 h,滤过,合并滤液,减压浓缩至1 g·mL^-1,加乙醇至含醇量60%,放置24 h,滤过,滤液减压浓缩至含生药量0.1 g·mL^-1,即得。④归芍方提取物配方(Chinese medicine extract powder solution,PS,批号:20180502):按归芍方,按比例取各药味提取物,加水制备成含生药量0.1 g·mL^-1的溶液,即得。上述归芍方提取物采用高效液相色谱(HPLC)法,对不同提取方式样品中的关键质量指标芍药苷、阿魏酸进行了含量测定,以保证不同提取方式样品的质量相对均一。

胚胎培养液配制:量取纯水1000 mL,加氯化钠溶液调节电导率至550~580 μS·cm^-1,然后加入0.1 mg·mL^-1亚甲蓝溶液1 mL,混合均匀,即得。

DBP溶液配制:称取适量DBP,加入胚胎培养基混匀,得10 mmol·L^-1 DBP储备液,使用时稀释至所需浓度即可。

1.2.2 存活率检测 将挑选好的正常胚胎置于24孔板中,每孔12枚,分为5组,平行3次,加入胚胎培养基1.5 mL,从受精后30 h开始加入各浓度药物(0,10,10²,10³,10⁴ μg·mL^-1)1.5 mL,于给药24 和48 h观察胚胎存活数目,数据汇总后统计存活率。

1.2.3 给药方法 参照本课题组前述方法进行^[8],将正常斑马鱼胚胎置于3块6孔板中,给予胚胎培养基2 mL,饲养至受精后30 h,吸尽培养基;正常对照组每孔加入胚胎培养基2 mL,模型对照组每孔加入10 μmol·L^-1 DBP2 mL,给药组每孔除加入20 μmol·L^-1 DBP1 mL外分别加入 ME、PS、MEA(200,100和20 μg·mL^-1)1 mL,饲养18 h。吖啶橙染色并在体式显微镜下观察眼部凋亡细胞,采集图片并进行数据处理。

1.2.4 图片采集及数据处理 将胚胎放入有0.5 mg·mL^-1蛋白酶E溶液的培养皿中,在室温下放置8 min;当胚胎有个别开始脱膜时,立即加入胚胎培养液稀释终止脱膜,迅速将脱膜后的胚胎移入干净的培养皿中,漂洗2次后,用5 μg·mL^-1吖啶橙在暗室中染色1 h,接着用胚胎培养液漂洗3次,每次5 min,然后用0.04 mg·mL^-1MS-222 溶液1 mL 麻醉5 min,置载玻片上于荧光显微镜下镜检摄像,眼部凋亡细胞呈绿色荧光,采用Image J软件对斑马鱼眼部凋亡细胞数进行统计。

1.2.5 免疫印迹(Western blotting)法检测凋亡相关基因Bcl-2蛋白的表达量 收集给药结束后斑马鱼胚胎,提取蛋白,二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid,BCA) 法测定蛋白浓度。免疫印迹法测定Bcl-2蛋白的表达量。Bcl-2一抗(稀释比例1:1000),4 ℃孵育过夜。常温摇床孵育兔二抗1 h,于数字化凝胶成像工作站曝光,Image Lab灰度值统计分析,根据凝胶成像结果检测Bcl-2蛋白表达量。

1.2.6 实时荧光定量PCR检测线粒体mtDNA 拷贝数的变化 本实验选择线粒体mtDNA上的mt-cytb作为目的基因,单拷贝基因核基因GAPDH作为内参。所使用的引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,引物序列见表1。

收集给药结束后斑马鱼,漂洗结束后将幼鱼分组吸入无酶EP管中,按照DNA快速抽提试剂盒说明书提取总DNA,稀释DNA样本至终浓度20 ng·μL^-1。然后使用实时荧光定量PCR仪对线粒体mtDNA上的mt-cytb基因以及单拷贝核基因GAPDH进行定量,每组各3 个平行样本。反应结束后通过溶解曲线分析确定产物的特异性。采用2^{- ΔΔCt} 对PCR结果进行相对定量分析。其中线粒体DNA拷贝数(mitochondrial DNA copy number,mtDNAcn)表示为mt-cytb基因与GAPDH基因表达的相对比值。

1.2.7 统计学方法 采用SPSS 22.0版统计软件,对实验数据进行正态性检验,均符合正态分布。计量资料以均数±标准差($\bar{x}\pm s$)表示,使用GraphPad Prism7.0版进行数据统计,采用one-way ANOVA分析比较各组间差异,Dunnett's T3检验进行组间比较,以 P<0.05为差异有统计学意义。

归芍方不同提取物对斑马鱼存活率的影响,结果见图1。给药24 h后,10⁴ μg·mL^-1MEA、PS显著降低斑马鱼胚胎存活率(P<0.01);给药时间延长至48 h后,10⁴ μg·mL^-1ME及10³ μg·mL^-1PS开始表现出明显的胚胎致死性(P<0.01)。其余浓度药物给药24 及48 h对胚胎存活率无显著影响。

结合存活率实验结果,采用无显著影响的100 μg·mL^-1及其以下浓度的归芍方提取物来探究对斑马鱼眼部细胞凋亡的影响。在受精后30 h的斑马鱼培养基中加入10 μmol·L^-1 DBP与不同浓度ME、MEA、PS(10,50,100 μg·mL^-1)共培养18 h。结果见图2。与正常对照组比较,模型对照组斑马鱼眼部细胞凋亡数目显著增加(P<0.01)。与模型对照组比较,1 μmol·L^-1人参皂苷Rg1组斑马鱼眼部细胞凋亡数目显著降低(P<0.01);10 μg·mL^-1 MEA和PS组斑马鱼眼部细胞凋亡数目显著降低(P<0.01);100 μg·mL^-1ME及中、高浓度MEA、PS组斑马鱼眼部细胞凋亡数目均显著降低(P<0.01)。提示3种归芍方提取物均能拮抗斑马鱼眼部细胞凋亡,且与ME组比较,PS和MEA组抗眼部细胞凋亡作用更为显著。

结果见图3。与正常对照组比较,模型对照组Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。与模型对照组比较,人参皂苷Rg1组Bcl-2蛋白表达水平显著提高(P<0.01)。与模型对照组比较,中、高浓度归芍方显著增加Bcl-2蛋白表达量(P<0.05,P<0.01)。结果表明,归芍方能够有效提高DBP损伤后模型斑马鱼细胞凋亡相关Bcl-2蛋白的表达,从而有效抑制细胞凋亡。

结果见图4,与正常对照组比较,模型对照组线粒体mtDNA拷贝数显著降低(P<0.01),给予不同浓度归芍方后,线粒体mtDNA拷贝数均呈上升趋势,其中100 μg·mL^-1剂量组与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结果表明,归芍方能够有效升高凋亡细胞线粒体mtDNA拷贝数,对线粒体功能具有保护作用。