蝙蝠葛苏林碱对转染人胚肾细胞T型钙通道亚型(CaV3.1)电生理特性的作用

余玲¹, 丁杰², 郭莲军²^,

1.湖北省宜昌市夷陵区妇幼保健计划生育服务中心,宜昌 443100

2.华中科技大学同济医学院药理教研室,武汉 430030

YU Ling¹, DING Jie², GUO Lianjun²^,

1.Maternal and Child Health Care and Family Planning Service Center of Yiling District, Yichang City, Hubei Province, Yichang 443100,China

2. Department of Pharmacology, School of Basic Medical Sciences, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China

作者简介:余玲(1971-),女,湖北宜昌人,副主任医师,学士,研究方向:妇产科临床与慢性病防治。电话:0717-8850169,E-mail:2900072512@qq.com。

通信作者:郭莲军(1953-),女,湖北天门人,教授,博士生导师,硕士,主要研究方向:神经药理。电话:027-83691763,E-mail:ljguo@hust.edu.cn。

中图分类号: R282.71;R285.5 文献标识码: A 文章编号: 1004-0781(2018)05-0527-04

摘要: 目的探讨蝙蝠葛苏林碱(DS)对转染人胚肾细胞(HEK293)表达的T型钙通道亚型(Ca_V3.1)电生理特性的作用。方法采用体外培养人胚肾细胞细胞,转染T型钙通道亚型(Ca_V3.1),用全细胞膜片钳技术记录在转染表达的T型(Ca_V3.1)钙电流,并观察DS对该钙通道亚型电生理特性的影响。结果在钳制电位(-110 mV),DS在1~10 μmol·L^-1浓度范围内呈浓度依赖性抑制人胚肾细胞表达的ICaV3.1电流,1,3,10 μmol·L^-1DS抑制率分别为(16.97±3.25)%,(37.92±5.76)% 和(53.50±9.65)%;在钳制电位分别为-110和-70 mV时,3 μmol·L^-1DS对ICaV3.1抑制率分别为(37.92±5.76)%和 (40.29±6.72)%(P>0.05);对T型(Ca_V3.1)钙通道失活常数t_inact值分别为(30.49±0.13),(30.18±0.06)ms(P>0.05)。结论 DS对人胚肾细胞表达的T型钙通道Ca_V3.1电流具有抑制作用,呈浓度依赖性,非电压依赖性,且对该通道失活过程无影响。

关键词: 蝙蝠葛苏林碱 ; 人胚肾细胞 ; 钙通道 ; T型

Abstract:

Objective To investigate the effects of daurinsoline (DS) on electrophysiological characteristics of T-type calclium channel Ca_V3.1 in transfected human embryonic kidney cells. Methods Human embryonic kidney cells cultured in vitro and transfected into T type calcium channel subtype (Ca_V3.1).The whole-cell patch clamp technique were used to record ICaV3.1 expressed in transfected human embryonic kidney cells .The influence of DS on the electrophysiological characteristics of this calclium channel was observed. Results At holding potentials (HPs) of -110 mV, DS (1,3 and 10 μmol·L^-1)could inhibit the ICaV3.1 expressed in a dose-dependent manner in transfected human embryonic kidney cells . The inhibition rates of 1,3,10 μmol·L^-1 DS were (16.97±3.25)%,(37.92±5.76)% and (53.50±9.65 )%, respectively. At HPs of -110 mV and -70 mV, the inhibition rates of DS at 3 μmol·L^-1 on ICaV3.1 were (37.92±5.76 )% and( 40.29±6.72 )%, which had no significant changes(P>0.05);The value of t_inact,which refers to the inactivation constant of T-type Ca_V3.1, were (30.49±0.13)and (30.18±0.06) ms (P>0.05), respectively. Conclusion DS can inhibit the ICaV3.1 expresssion in a dose-dependent and voltage-independent manner in transfected human embryonic kidney cells, while has no influence on inactivation of T-type Ca_V3.1.

Key words: Daurisoline ; Human embryonic kidney cells ; Calcium channel ; T-type

T型钙通道是一类电导小的电压依赖性钙通道,其特点为激活电位较低、失活速度快、在体内分布广泛且具有多方面的功能。 T型钙通道广泛分布在哺乳动物组织各类型细胞中,包括心血管和神经细胞,与高电压钙通道不同,在接近膜静息电位的低度去极化时即能被激活,因而有利于心脏起搏和神经细胞在生理状态下接近静息时,对兴奋和电反应的调节^[1]。近年来,克隆出3种T型钙通道α1亚单位基因(Ca_V3.1,Ca_v3.2和Ca_v 3.3),为深入研究T型钙通道的病理生理特性及药物作用的选择性提供了良好的研究工具。T 型钙通道在神经细胞和非神经细胞中均对膜兴奋性有着重要作用,如T 型钙通道Ca_v3亚型的功能异常则会导致许多疾病如高血压、心脏病、疼痛、癫、自闭症和癌症^[2,3]等。近年对调控T型钙通道亚型活性的分子机制的研究,对促进相关新药的开发研究具有重要启迪。因此积极寻找选择性阻滞T型钙通道亚型的生物活性物质,对治疗心血管及神经系统疾病具有重要应用意义。

蝙蝠葛苏林碱(daurisoline,DS)是从北豆根即防己科植物蝙蝠葛(menispermum dauricum DC)根茎中提取的主要有效成分,属双苄基喹啉类生物碱,已证实具有显著的抗实验性心律失常作用^[4]。还能抗各种因素引起的心肌迟后除极(delayed afterdepolarizations,DADs)^[5],非使用依赖性的延长家兔在体心脏单相动作电位时程,并可抑制奎尼丁以及氯化铯诱发的心肌早后除极^[6]。豚鼠乳头肌实验同时也证明,DS延长动作电位的程度随刺激频率的增加而增大,呈正性使用依赖性。近期的研究还发现蝙蝠葛碱有很多与抗肿瘤相关的生物活性,包括调节T细胞活性,诱导细胞凋亡,抑制乳腺癌细胞增生及防治机体对药物的耐药性等,但具体的相关作用机制还不明确。因此笔者在前期的研究基础上,应用培养的人肾胚胎细胞特异性转染T-型钙通道亚型(Ca_V3.1),应用全细胞膜片钳技术,进一步探讨DS对T-型钙通道亚型电生理特性的影响,以深入阐明DS的相关作用机制,为该化合物的开发应用提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

DS(淡黄色粉末,分子量为610.7,含量>98%,华中科技大学同济医学院药理学系提供),用1 mmol·L^-1盐酸溶解,再用2 mol·L^-1氢氧化钠(NaOH)溶液调节pH值至6.8,配成母液,4 ℃保存,用时稀释至所需浓度。胰蛋白酶,胎牛血清(美国Sigma公司);多聚-L-赖氨酸(BIOCHROMAG公司,德国);达尔伯克必需基本培养液(DMEM),二甲亚砜(DMSO,GIBCO公司 );其余药品和试剂均为市售分析纯,所有药物均溶解为储备液,冰冻保存,实验时将这些药物用细胞外液稀释至终浓度。磷酸盐缓冲液(PBS)组成:氯化钠(NaCl) 2.0 g,氯化钾(KCl )0.05 g,磷酸氢二钠(Na₂HPO₄) 0.87 g,磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 0.05 g用双蒸水溶解并加至250 mL,调节pH值为7.3。高压滤过,4 ℃保存。

膜片钳电极外液的组成成分:氯化镁(MgCl₂)1 mmol·L^-1,氯化钡(BaCl₂)30 mmol·L^-1,D-葡萄糖5 mmol·L^-1,4-羟乙基哌嗪乙磺酸10 mmol·L^-1,NaCl 150 mmol·L^-1,用NaOH 调节pH值至7.4。膜片钳电极内液组成成分:三乙醇胺-氯10 mmol·L^-1,氯化铯130 mmol·L^-1,MgCl₂5 mmol·L^-1,依他酸10 mmol·L^-1,三磷酸腺苷二钠5 mmol·L^-1,4-羟乙基哌嗪乙磺酸10 mmol·L^-1,用氢氯化铯溶液调节pH值至7.4。

1.2 仪器

膜片钳放大器Axonpatch 200B,P-97 型微电极拉制仪和MP-285 型微操纵器(美国 Sutter 公司),Axiovert 200 型倒置显微镜 (德国 Zeiss 公司)。

1.3 人胚肾细胞株的复苏与培养

成功转染T-型钙通道亚型Ca_V3.1的人胚肾细胞株,由德国慕尼黑工业大学药理学与毒理学研究所惠赠。首先将冻存细胞株管放入37 ℃水浴中,轻微摇动,融化,将溶解的细胞冻存管取出,吸出冻存液,加入事先装好培养液的离心管内,吹打混匀,用1 000 r·min^-1(r=15.0 cm)离心5 min,弃上清液,加入适量培养液,吹打细胞悬液,以1×10⁵·mL^-1密度接种于培养瓶内,置于37 ℃、5.5%二氧化碳(CO₂)的培养箱内饱和湿度培养,每48 h换液1次。将培养好的细胞用0.25%胰酶消化1~2 min,将培养瓶用手掌轻轻敲打使细胞脱壁、悬浮、分散,获得所需密度的细胞悬液。在6%CO₂培养箱37 ℃孵育24~48 h,在倒置显微镜下观察并记录细胞的生长情况及形态特征。

1.4 全细胞膜片钳记录及数据的采集和分析

选取人胚肾细胞(直径 20~30 μm),在室温(20~22 ℃)下进行实验。全细胞钳制在直径35 mm 培养皿中通过倒置显微镜完成。首先将玻璃微电极内给予正压,通过三维微操纵仪使电极尖端进入细胞外液,当电极尖端与细胞膜表面接触,此时通过注射器施加一负压,进入细胞内(即破膜,电极内负压打孔),形成全细胞记录模式,示波器上出现来自细胞膜的跨膜电流。

电流记录方法:将细胞钳制在-90 mV,以步长20 mV的阶跃方波脉冲刺激,脉冲持续时间为 400 ms。实验中的采样频率为10 kHz,随后经3 kHz滤波。当电流稳定后,开始实验,记录,作为给药前参数值,然后通过多孔道微注射系统,将药物直接加入培养皿。然后进行给药前后比较,评价药物的作用。

信号采集:经Ag/AgCl电极引导,由膜片钳放大器放大,用Clamfit 9.2版(美国)软件采集和处理数据。结果分析采用GraphPad Prism4软件进行曲线拟合和相关参数的计算。

浓度依赖性曲线采用Hill方程拟合:I/I_max=1/[1+(EC₅₀/C)n],I为给药后的电流幅度,I_max是对照电流幅度,C为药物浓度,而n是Hill系数。电导计算采用公式:G=I/(V_m-V_rev),V_m为所测电流值的膜电位,V_rev是钙通道翻转电位。

1.5 统计学方法

数据统计分析应用 SPSS 6 .0 版软件进行,所有数据均用均数±标准差( $\begin{matrix} \bar{x} \end{matrix}$ ±s)表示,给药前后差异分析采用配对t检验和两组独立样本的差异检验应用t检验,以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DS对人胚肾细胞的T型钙通道Ca_V3.1电流的影响

钳制电位为-110 mV,测试电压为-20 mV时,DS 1,3和10 μmol·L^-1对 $\begin{matrix} I_{C a_{V} 3.1} \end{matrix}$ 抑制率分别为(16.97±3.25)%,(37.92±5.76)% 和(53.50±9.65)%;钳制电位为-70 mV,测试电压为-20 mV时,DS 1,3和10 μmol·L^-1对 $\begin{matrix} I_{C a_{V} 3.1} \end{matrix}$ 抑制率分别为(20.51±4.97)%,(40.29±6.72)%和(61.86±7.87)%。见图1。

图1 在不同钳制电位下DS对人胚肾细胞表达Ca_V3.1电流的抑制作用(x¯±s,n=6)
A.钳制电位为-110 mV下的原始电流图; B.钳制电位为-70 mV下的原始电流图;C.-110 mV钳制电位下1,3 和10 μmol·L^-1DS对ICaV3.1抑制百分率;D.-70 mV钳制电位下1,3 和 10 μmol·L^-1DS对ICaV3.1抑制百分率;与1 μmol·L^-1DS比较,^*1P<0.05,^*2P<0.01

Fig.1 Inhibitory effects of DS on Ca_V3.1 in human embryonic kidney cells at different holding potentials(x¯±s,n=6)
A.Original current diagram of holding potentials at-110 mV;B. Original current diagram of holding potentials at-70 mV;C. Percentage of I_Cav3.1. inhibition by 1,3,10 μmol·L^-1 DS at holding potential of -110 mV;D . Percentage of I_Cav3.1. inhibition by 1,3,10 μmol·L^-1 DS at holding potential of -70 mV;Compared with 1 μmol·L^-1 DS,^*1P<0.05,^*2P<0.01

2.2 DS对人胚肾细胞的T型Ca_V3.1 钙通道I-V曲线的影响

电流稳定后,加入不同浓度的DS,以各脉冲下峰电流密度(pA/pF)对相应电位作图得I-V曲线。结果见图2。

图2 DS在不同钳制电位下对人胚肾细胞表达的Ca_V3.1电流的抑制作用
A.钳制电位为-110 mV下的电流-电压曲线关系; B.钳制电位为-70 mV下的电流-电压曲线关系

Fig.2 Inhibitory effects of DS on Ca_V3.1 in human embryonic kidney cells at different holding potentials
A.Curve of current versus voltage at holding potential of -110 mV;B. Curve of current versus voltage at holding potential of -70 mV

2.3 DS对人胚肾细胞表达的T型Ca_V3.1钙通道失活的影响

分别在钳制电位为-110或-70 mV下,去极化到-20 mV,100 ms的方波脉冲刺激,观察3 μmol·L^-1DS对T型钙通道Ca_V3.1亚型的失活过程的影响。结果显示,钳制电位为-110 mV时,给DS前后t_inact值分别为(23.67±0.1),(24.06±0.06)ms;钳制电位为-70 mV时,给DS前后t_inact值分别为(30.49±0.13),(30.18±0.06) ms,在-110或-70 mV两种钳制电位时,DS前后t_inact值均差异无统计学意义(P>0.05,n=6),提示DS对T型Ca_V3.1钙通道失活过程无影响。结果见图3。

图3 在不同钳制电位下DS对人胚肾细胞T型钙通道Ca_V3.1失活过程的影响
A.钳制电位为-110 mV时,DS对T型钙通道Ca_V3.1失活的电流图;B.根据图A得出的DS作用的失活常数(t_inact)与时间的关系统计图;C.钳制电位为-70 mV时,DS对T型钙通道Ca_V3.1失活的电流图; D.根据图C所得的DS作用的失活常数(t_inact)与时间的关系统计图

Fig.3 Inacitivation kinetics of Ca_V3.1 channel in human embryonic kidney cells by DS at different holding potentials
A.ICaV3.1 representative current traces in the presence of DS at holding potentials of -110 mV;B. Curve of t_inact of DS versus time according figure A;C.I_Cav3.1. representative current traces in the presence of DS at holding potentials of -70 mV;D. Curve of t_inact of DS versus time accrording figure C

3 讨论

本实验显示在两种钳制电位-110与-70 mV时,DS在1,3,10 μmol·L^-1浓度范围内,呈浓度依赖性抑制T型钙通道Ca_V3.1亚型电流,但在两种不同的钳制电位对该电流抑制百分率无明显差异,提示钳制电位的大小并不影响DS与通道结合,即DS对T型钙通道Ca_V3.1具有非电压依赖性抑制作用。这一作用特点,与已知的特异性T型钙通道阻断药米贝地尔有明显不同。与之比较,米贝地尔对T型钙通道Ca_V3.1亚型的抑制作用具有明显的电压依赖性,而DS对 $\begin{matrix} I_{C a_{V} 3.1} \end{matrix}$ 的抑制作用则不受钳制电位的影响,其抑制作用为非电压依赖性的。

为了进一步阐明DS对T型钙通道Ca_V3.1电生理特性的作用,笔者应用培养人胚肾细胞表达的T型钙通道Ca_V3.1,观察DS对Ca_V3.1电流失活过程的影响。结果显示,在钳制电位为-110或-70 mV时,应用DS(3 μmol·L^-1)处理前后的t_inact值均差异无统计学意义(P>0.05,n=6)。提示DS对人胚肾细胞表达的T型钙通道Ca_V3.1亚型的抑制,并不影响其失活过程。

以往研究报道,许多天然植物有效成分具有钙通道抑制作用,如白花前胡甲素^[7]、钩藤碱^[8]、川芎嗪^[9]、丹皮酚^[10]、芍药苷^[11]都是浓度依赖性地抑制心肌细胞L型钙通道。而灯盏花素^[12]通过电压依赖性和浓度依赖性减少心肌细胞L型钙电流。相对而言,对T型钙通道具有抑制作用的天然植物有效成分报道较少。

综上所述,DS对T型钙通道Ca_V3.1电生理特性的作用的特点,主要表现为非电压依赖性抑制,且对该通道的失活过程无明显影响。本研究结果对阐明DS对某些疾病的治疗作用提供了一定的理论和实验依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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