壳聚糖是一种天然线性生物多糖,由氨基葡萄糖与N-乙酰氨基葡萄糖单元组成,具有抗氧化、抗菌、抗凝血和抗肿瘤等活性^[1],可在溶菌酶的作用下降解,降解后的产物与细胞外基质的某些成分结构类似,降解速率随脱乙酰化程度的降低而增高^[2]。因具有优越的生物相容性、良好的生物粘附性和可控的生物降解性,壳聚糖被广泛应用于组织工程的研究。以壳聚糖为主要原料制备的水凝胶可携带细胞和(或)生长因子对损伤的组织进行修复或替代,具有以下特点:①质地柔软,富有弹性,与活体组织质感相近;②以溶液状态给药后在用药部位发生相转变,形成半固体状态;③可模拟细胞外基质,提供适宜细胞生存的微环境;④对周围组织的摩擦和机械刺激小等^[3]。目前壳聚糖类水凝胶作为一种尚在开发的生物修复材料,已应用于骨、软骨、皮肤和心肌等组织工程研究中,笔者对壳聚糖类水凝胶在组织工程中的应用和研究进展进行综述。

骨缺损的修复一直是临床治疗的一大难题。目前,临床上主要采用骨移植或人工骨替代材料进行骨缺损的修复。骨移植因存在来源有限、免疫排斥和具有感染风险等问题应用受限,这使得骨组织工程的研究与发展成为人们关注的热点。

壳聚糖与成骨细胞有很好的生物相容性,可支持成骨细胞的黏附和增殖^[4]。但是由于存在机械强度差的问题,众多研究者将目光集中在壳聚糖复合材料上。锶可以促进骨形成,减少骨质吸收,在骨重塑过程中起到重要作用。壳聚糖-甘油磷酸盐/羟乙基纤维素系统是目前研究较多的温敏性壳聚糖水凝胶体系。SU 等^[5]制备了由锶、明胶、壳聚糖和β-甘油磷酸组成的水凝胶,以其传递源于人脱落乳牙的干细胞。结果发现水凝胶可诱导生物矿化和碱性磷酸酶高表达,同时使骨相关基因包括Ⅰ型胶原蛋白、Runx2、骨桥蛋白和骨粘连蛋白的表达水平上调。温敏性锌(Zn)壳聚糖/β-甘油磷酸水凝胶不但可以增强壳聚糖的抗菌活性,而且可促进成骨细胞分化^[6]。DHIVYA等^[7]也应用壳聚糖-甘油磷酸盐体系制备了温敏性Zn-壳聚糖/β-甘油磷酸和Zn-壳聚糖/纳米羟基磷灰石/β-甘油磷酸水凝胶。结果表明纳米羟基磷灰石的加入可增强体外成骨细胞的分化,加速体内骨质形成。羟基磷灰石和β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)是目前研究和应用较多的生物活性陶瓷材料,β-TCP具有良好生物相容性、骨传导性和生物降解性。研究发现仿生的温敏β-TCP/壳聚糖水凝胶,在体温下可发生溶胶凝胶转换,能够模拟骨组织,可用于骨组织工程骨的修复^[8]。

壳聚糖类水凝胶也可以作为生长因子的传递载体,起到缓释作用,利于组织修复或替换。KIM等^[9]利用紫外光辐射交联制备了光交联壳聚糖-丙交酯水凝胶用于传递与成骨细胞分化和矿质化有关的骨形态形成蛋白因子-2,生长因子的持续释放使得骨矿质化增强,碱性磷酸酶活性提高。此外,有研究表明同时负载碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和骨形态形成蛋白因子-7的凝胶,与单一因子的凝胶比较,碱性磷酸酶活性更高,更利于骨组织的修复^[10]。

上述研究结果表明,壳聚糖类水凝胶可成功封装成骨细胞或相关生长因子,达到促进骨形成、修复骨缺损的目的,若同时负载细胞和生长因子则修复效果更佳。

据报道,世界约6.3亿人受到骨关节炎影响^[11]。关节损伤或骨关节炎会导致软骨缺损,软骨由于本身缺乏血管,一旦损伤很难自身修复。软骨组织工程为软骨损伤的治疗和透明软骨组织再生提供了新的途径。壳聚糖与软骨基质中的主要成分——氨基葡聚糖结构类似,是一种良好的软骨细胞载体。NADERI-MESHKIN 等^[12]将软骨生长因子或间充质干细胞封装在壳聚糖/β-甘油磷酸/羟乙基纤维素水凝胶中,并注射到损伤部位,结果发现水凝胶可以为人间充质干细胞的软骨分化提供适宜的微环境,促进软骨修复。随着研究的不断深入,壳聚糖复合支架也应用于软骨组织工程。由Ⅱ型胶原和壳聚糖构成负载间充质细胞和软骨细胞的水凝胶可显著增加细胞聚集、软骨形成以及软骨细胞外基质的沉积^[13]。明胶是变性的胶原,可以促进软骨细胞粘附、迁移和分化。ZHAO 等^[14]采用冷冻干燥和化学交联的方法制备了光交联壳聚糖-明胶支架用于软骨细胞的体外培养,并将此支架整合到海藻酸钠中获得温敏性水凝胶。此水凝胶可支持软骨细胞增殖超过21 d,具备良好的细胞相容性,并且维持软骨细胞球型形态,这种形态可促进软骨细胞表达更多的Ⅱ型胶原蛋白。

此外,为了模拟机体组织多糖/胶原蛋白成分和软骨/骨界面组织的多层梯度结构,HAN等^[15]研制了层状的明胶-壳聚糖水凝胶。发现其细胞相容性好,表层、中间层和深层的孔隙分别是(115±30),(94±34)和(51±12) μm,孔隙率均>80%,抗压强度分别是(165±54),(565±50)和(993±108) kPa,梯度凝胶张力沿厚度方向下降,与机体组织类似。另外,水凝胶对体内骨软骨缺损修复结果明显,尤其是负载促软骨形成因子—转化生长因子β₁(transforming growth factor -β₁,TGF-β₁)时。还有学者将其结合到浸有Ⅱ型胶原蛋白的甲基丙烯酸酯乙二醇壳聚糖水凝胶上。结果发现,水凝胶体系可封装人类滑膜来源的间充质干细胞。Ⅱ型胶原蛋白和TGF-β₁的加入显著增强细胞聚集和软骨细胞外基质的沉积^[16]。

综上所述,壳聚糖类水凝胶,特别是由软骨外基质成分Ⅱ型胶原蛋白和壳聚糖组成的水凝胶可模拟软骨组织,对损伤的软骨进行修复。

当皮肤受到损伤时,机体自身会进行生理性修复,然而大面积的烧伤、软组织创伤和皮肤坏死性疾病等导致的皮肤缺损,已超出机体的代偿范围,这时就需要进行皮肤移植,但临床的供体皮肤严重不足,皮肤组织工程的出现可有效的解决这一难题。用于皮肤组织工程的支架材料应具有良好的生物相容性、可降解性、透气性、保湿性和抑菌性等特点,大量研究表明,壳聚糖及其衍生物具备上述特性,已被广泛应用于皮肤组织工程的研究。

CHANG等^[17]将N-羧甲基壳聚糖用作治疗深Ⅱ度烧伤的生物材料,结果表明N-羧甲基壳聚糖无毒,生物相容性好并可加速伤口愈合。HUANG等^[18]通过大鼠植入模型和全层皮肤伤口模型评估羧甲基壳聚糖/明胶水凝胶的生物相容性、生物降解能力和对伤口愈合程度的影响。在移植实验中,羧甲基壳聚糖可促进细胞增殖和新血管形成,明胶可有效稳定水凝胶结构和延长降解时间。伤口愈合实验结果证明羧甲基壳聚糖/明胶水凝胶可以诱发肉芽组织形成,加速伤口愈合。正常皮肤具有表皮和真皮层,表皮比较薄,可以起到屏障作用,真皮比较厚,包含成纤维细胞,使皮肤具有弹性和韧性。为了更好地促进皮肤愈合和再生,研究者通过电纺丝法和戊二醛化学交联法制备了仿生的双层支架,即聚已酸内酯/聚乳酸-羟基乙酸共聚物膜与壳聚糖-明胶水凝胶,发现聚已酸内酯/聚乳酸-羟基乙酸共聚物层的加入可增加支架的机械性能,降低水凝胶的降解速率,但不影响支架的生物相容性,水凝胶层孔隙率>97%,可支持成纤维细胞增殖^[19-20]。类似的,TSAO 等^[21]制备了壳聚糖-海藻酸和壳聚糖-聚乙二醇双层皮肤支架材料,封装有成纤维细胞的温敏壳聚糖-聚乙二醇凝胶层模拟真皮,角质细胞种植在双层支架材料上方模拟表皮,结果发现壳聚糖-聚乙二醇的存在会增加成纤维细胞和角质细胞的增殖率,气-液界面可诱导角质细胞成熟。

负载表皮生长因子的泊洛沙姆/壳聚糖水凝胶可促进皮肤伤口愈合^[22]。CHOI等^[23]用化学光交联反应将环氧丙基甲基丙烯酸甲壳低聚糖与二丙烯酸酯泊洛沙姆F127以不同比例混合制备成水凝胶,用负载bFGF和肝素复合物的水凝胶传递皮肤成纤维细胞,研究发现提高甲壳低聚糖含量可增加水凝胶的力学性能。此外,水凝胶可以持续释放bFGF并促进皮肤成纤维细胞增殖。

以上实验结果证实,壳聚糖类水凝胶与皮肤组织生物相容性好,可促进皮肤伤口愈合,特别是其仿生的双层支架可更好模拟皮肤真皮和表皮结构,促进皮肤组织再生,提示此支架材料在皮肤损伤的治疗上具有很大的应用潜能。

每年约7 300万例患者死于心肌梗死,预测未来还会有增加趋势^[24]。目前的治疗措施虽然能在一定程度上缓解患者症状,但却无法根治。当疾病发展到晚期时,心脏移植是唯一的救命手段,但往往受限于供体来源的短缺。可注射心肌组织工程因具有修复受损心肌的潜能,为心血管疾病的治疗带来希望,日渐成为国内外学者研究的热点。

已有文献证实壳聚糖类水凝胶可以作为传递载体携带种子细胞对损伤的心肌进行修复。壳聚糖水凝胶与0.9%氯化钠溶液比较,可有效提高心肌梗死移植细胞的传递和急性保留^[25]。LIU 等^[26]研究发现温敏性壳聚糖水凝胶可显著提高间充质干细胞在心肌内的滞留和存活,促进其向缺血心肌迁移及归巢。此外,还可以增加心肌梗死区室壁厚度和血管密度,减小心肌梗死面积。WANG等^[27]观察到壳聚糖可提高棕色脂肪来源干细胞的移植生存率,显著增加其在体内向心肌细胞分化的程度。此外,壳聚糖水凝胶传递的干细胞还有预防不良的基质重塑,增加血管生成的作用。

改性壳聚糖及壳聚糖复合支架材料在心肌组织工程中的应用日益增多。LI等^[28]将谷胱甘肽连接在壳聚糖上,所制备的水凝胶生物相容性好,可消除细胞内过多的活性氧,进而抑制心肌细胞的氧化应激损伤和细胞凋亡。SHU等^[29]制备了温敏的由RoY-壳聚糖、β-甘油磷酸盐和羟乙基纤维素组成的水凝胶,观察发现RoY肽与壳聚糖共轭并未影响其温度敏感性,但可增加黏度,缩短胶凝时间。药效学研究表明RoY的引入不仅可以促进心肌梗死区域血管的生成,也可改善心脏功能。相似的,REIS等^[30]制备了血管生成素-1-衍生多肽固定化壳聚糖-胶原水凝胶。与对照组比较,梗死区可见更多的心肌细胞,瘢痕厚度和心脏功能显著提高。同时,水凝胶的注射并未引起明显的炎症反应。此外,在大鼠急性心肌梗死模型中,局部注射海藻酸-壳聚糖水凝胶于梗死周围区,8周后发现梗死扩张和瘢痕纤维化减少,血管生成和对梗死区内源性修复的募集增加^[31]。

水凝胶可有效地传递促血管生长因子,如携带bFGF可诱导缺血心肌梗死区域再血管化,改善心脏功能,还能对其携带的生长因子起缓释作用,这都对缺血性心脏疾病的治疗具有重要意义。WANG等^[32]将心肌梗死1周的大鼠模型随机分为4组:注射磷酸盐缓冲液组;注射壳聚糖水凝胶组;注射磷酸盐缓冲液+bFGF组;注射壳聚糖+bFGF组(n=8),发现壳聚糖+bFGF组心肌梗死区域小动脉密度和心脏功能明显提高,梗死和纤维化的面积明显减少。

由此可见,不论是壳聚糖、壳聚糖衍生物还是壳聚糖复合材料都可以传递心肌/干细胞或促血管生长因子,起到改善心脏功能、修复受损心肌的作用。尽管现在关于壳聚糖类水凝胶在心肌组织工程中的应用文献报道较少,但从研究结果可看出其在心脏相关疾病的治疗上具有广阔的应用前景。

随着壳聚糖类水凝胶研究的不断深入,研究者发现其在神经、角膜和髓核等组织工程中也可发挥重要作用。LI等^[33]用含有D-甘露醇晶体的甲基丙烯酰胺壳聚糖水凝胶来传递神经干/祖细胞的干细胞(neural stem/progenitor cells,NSPCs)。D-甘露醇晶体作为致孔剂可提高水凝胶的孔隙大小,NSPCs培养14 d发现其可明显的分化成所需的细胞类型,同时,较大孔隙的水凝胶可有效地促进NSPCs分化。由于对供体角膜的高需求和其低供应,自体角膜内皮细胞培养和移植对治疗角膜内皮功能障碍非常必要。OZCELIK等^[34]制备了超薄的壳聚糖-聚乙二醇水凝胶薄膜用于角膜组织工程研究。光透射测量显示,薄膜光学透明度>95%,高于人类的角膜。细胞培养结果证明该薄膜可支持羊角膜内皮细胞粘附和增殖。SMITH等^[35]研制了用于椎间盘髓核再生的由葡聚糖、壳聚糖和硬骨鱼组成的可注射水凝胶。髓核细胞和水凝胶共同培养14 d,发现水凝胶无细胞毒性,可维持髓核细胞的生存并促进其增殖。壳聚糖类水凝胶在上述组织工程中的研究都还处于起步阶段,相信未来其在此方面的研究也一定会日臻成熟。

壳聚糖来源丰富,成本低廉,有良好的生物相容性,是抗氧化、可注射、可生物降解的天然高分子材料。壳聚糖类水凝胶携带细胞或生长因子可增加移植细胞的滞留和存活,起到修复受损组织,促进组织再生的作用。壳聚糖作为组织工程修复材料具有广阔的应用前景。目前组织工程水凝胶材料的研发还都处于基础研究阶段,尚有很多问题亟待解决,例如壳聚糖水凝胶若应用于临床,关于所传递细胞和生长因子种类的选择,注射的剂量和时间,体内的降解速度,力学强度与组织的匹配程度等问题均需进一步深入研究。