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医药导报
医药导报, 2019, 38(3): 304-308
doi: 10.3870/j.issn.1004-0781.2019.03.004
高乌甲素脂质体凝胶镇痛抗炎作用与皮肤刺激性*
Analgesic, Anti-Inflammatory Effect and Skin Irritation of Lappaconitine Liposome Gel
徐蕾1,, 杨爱霞2,, 肖卫红2
1.湖北中医药大学药学院,武汉 430065
2.武汉市第一医院药学部,武汉 430022
XU Lei1,, YANG Aixia2,, XIAO Weihong2
1.School of Pharmacy,Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065,China
2.Department of Pharmacy,Wuhan First Hospital,Wuhan 430022,China
通讯作者 杨爱霞(1971-),女,河南柘城人,主任药师,硕士,研究方向:中药新药研发和临床药学。ORCID:0000-0003-3195-4838,电话:027-85332416,E-mail:yangaixia0407@163.com。

作者简介 徐蕾(1993-),女,湖北咸宁人,在读硕士,研究方向:药物新剂型与新技术。ORCID:0000-0001-8127-115X,E-mail:980422236@qq.com。
基金资助: 武汉市卫生计生委重点课题(WZ16A07)
文献标识码: A     文章编号: 1004-0781(2019)03-0304-05
摘要:

目的 考察高乌甲素脂质体凝胶经皮给药的药效及刺激性。方法 以高乌甲素凝胶为参照,通过小鼠热板法、小鼠扭体实验考察高乌甲素脂质体凝胶镇痛效果;大鼠佐剂性关节炎实验考察抗炎效果,观察指标包括足肿胀度、血清肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)、踝关节病理切片;家兔背部完整与破损皮肤实验考察高乌甲素脂质体凝胶对皮肤的刺激性。结果 与高乌甲素凝胶组比较,随着给药时间的延长,高乌甲素脂质体凝胶组对热敏感度下降,痛阈值增加,4 h时差异有统计学意义(P<0.01); 15 min时高乌甲素脂质体凝胶组扭体次数减少;大鼠足围减小,TNF-α、IL-2表达下降(P<0.05),炎症反应减弱;高乌甲素脂质体凝胶对皮肤无刺激性。结论 高乌甲素脂质体凝胶镇痛抗炎效果优于高乌甲素凝胶,且对完整和破损皮肤均无刺激性。
关键词: 高乌甲素脂质体凝胶 ; 镇痛 ; 抗炎 ; 皮肤刺激性

Abstract:

Objective To investigate the efficacy and skin irritation of transdermal formulations of lappaconitine liposome gel. Methods Analgesic effect of lappaconitine liposome gel and lappaconitine gel was investigated by mouse hot plate test and mouse writhing test.Adjuvant arthritis rat model was established to compare the anti-inflammatory effect of the two kinds of transdermal gel by measuring the degree of rat foot swelling, rat serum tumor necrosis factor (TNF-α) and interleukin-2 (IL-2), and observing pathological section of rat ankle joints as observation indexes.Skin irritability of lappaconitine liposome gel was observed by rabbit intact and damaged skin test. Results Compared with the lappaconitine gel group, pain threshold increased and sensitivity to heat decreased with time increase of administration in the lappaconitine liposome gel group, and the difference was statistically significant at 4 h (P<0.01).Frequency of writhing decreased in the lappaconitine liposome gel group at 15 min; the rat’s foot circumference decreased, the expression of TNF-α and IL-2 decreased (P<0.05), and the inflammatory reaction decreased; the lappaconitine liposome gel had nonirritant to the skin. Conclusion Lappaconitine liposome gel has better analgesic and anti-inflammatory effects than lappaconitine gel, and it is not irritant to intact or damaged skin.
Key words: Lappaconitine liposomes gel ; Analgesic ; Anti-inflammatory ; Skin irritation

高乌甲素(lappaconitine,LA)是从毛茛科植物高乌头根中提取的难溶性二萜类生物碱,具有良好的镇痛抗炎效果,应用前景较广泛。但高乌甲素水溶性极差,半衰期短,治疗窗窄[1],血药浓度存在峰谷现象,对黏膜有较强刺激性,注射时易引起局部不适[2],普通剂型难以克服这些缺陷。经皮给药脂质体具有生物相容性、缓释性、增溶等特点[3],是近年来研究的热点。笔者在本实验以脂质体为载体制备高乌甲素脂质体,并比较高乌甲素脂质体凝胶与高乌甲素凝胶给药效果。

1 材料与方法
1.1 试剂

高乌甲素原料(上海三新研究所,批号:20161006,含量:98.6%);无水乙醇(天津市风船化学试剂科技有限公司,含量>95%,批号:201403);胆固醇(上海山浦化工有限公司,含量:95%,批号:201404);卵磷脂(天津市科密欧化学试剂有限公司,批号:20170401,含量≥99%);卡波姆(山东优索化工科技有限公司,批号:16040605);三乙醇胺(天津市风船化学试剂科技有限公司,含量:85.0%,批号:201206);甲醇(西陇科学股份有限公司,含量≥99.5%,批号:201611);甲醛(湖北奥生新材料科技有限公司,含量:37.0%~40.0%,批号:110908);纯化水为自制三蒸水。大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司,批号:AKOO17DECO4016)、白细胞介素2(IL-2)试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司,批号:AKOO17DECO4017)。弗氏完全佐剂 (美国Sigma公司,批号:1002431819)。

1.2 仪器

BS124S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司,感量:1 mg);pH酸度计(上海仪电科学仪器);MK3型酶标仪(热电上海仪器有限公司)。

1.3 实验动物

昆明种(KM)小鼠,实验动物合格证号:42000600025229,42000600025518;Wistar大鼠,实验动物合格证号:42000600025813;日本大耳白兔,实验动物合格证号:42000600025722。均由湖北省实验动物研究中心提供,实验动物许可证号:00264380。

1.4 试药的制备

1.4.1 高乌甲素脂质体的制备 精密称取高乌甲素36 mg,卵磷脂320 mg,胆固醇40 mg,置于茄形瓶,加入二氯甲烷(CH2Cl2)10 mL超声溶解,旋蒸去除溶剂(23 ℃,140 r·min-1),使其在瓶壁形成均匀透明薄膜[4];10 mL、55 ℃、pH值7磷酸盐缓冲液(PBS)旋转洗膜,搅拌水化3 h,水浴恒温55 ℃,得脂质体粗品后超声震荡约3 min,即得,4 ℃冰箱保存。

1.4.2 脂质体凝胶的制备 称取0.18 g卡波姆940,将其均匀分散于8 mL纯化水中溶胀过夜,得基质,三乙醇胺调节pH值至6.5~6.8。将高乌甲素脂质体10 mL与基质混合均匀,即得到卡波姆940含量为1.0%的粘稠高乌甲素脂质体凝胶,4 ℃冷藏保存。

1.4.3 高乌甲素凝胶的制备 将0.18 g卡波姆均匀撒于10 mL纯化水上,同“1.4.2”项法制备凝胶,将高乌甲素36 mg用乙醇2 mL溶解,加纯化水至18 mL,充分搅拌。

1.4.4 空白凝胶的制备 将0.18 g卡波姆均匀撒于10 mL纯化水上,溶胀过夜,调节pH值至6.5~6.8即得。

1.5 实验原理及方法

1.5.1 热板实验 高乌甲素通过抑制电压依赖性Na+-Ca2+通道,抑制突触前膜对去甲肾上腺素(NA)和5-羟色胺(5-HT)的再摄取,增加两者在突触间隙含量,抑制传入神经纤维P物质释放[5],发挥阻碍中枢神经系统电信号传导作用,从而实现镇痛效果。小鼠热板实验可从中枢神经方面考察高乌甲素脂质体凝胶作用效果[6]。

取KM雄性小鼠30只,体质量(20±2) g。实验室温度 20~24 ℃,相对湿度 40%~70%[7]。将小鼠置于(55.0±0.5) ℃热板测痛仪上,记录自放入至小鼠舔后足所需时间(s),计为该鼠给药前基础痛阈值[8]。筛选出30 s内舔足小鼠,随机分为3组:空白对照组、高乌甲素脂质体凝胶组和高乌甲素凝胶组,8%硫化钠溶液腹部脱毛6 cm2,给药前再测1次痛阈值,取2次痛阈平均值作为给药前痛阈值。分别将空白凝胶、高乌甲素脂质体凝胶及高乌甲素凝胶0.15 mL涂于腹部,用药后0.5,1,2,4 h测定痛阈。

1.5.2 扭体实验 高乌甲素能通过抑制脑导水管周围灰质和皮质细胞Ca2+内流以及核因子κB表达,发挥周围镇痛作用[9]。笔者在本实验以小鼠扭体实验从周围神经方面考察高乌甲素脂质体凝胶作用效果。

取KM雄性小鼠30只,同“1.5.1”项饲养条件,随机分为3组,即空白对照组、高乌甲素脂质体凝胶组和高乌甲素凝胶组。腹部硫化钠脱毛,分别涂药品,药物与剂量同“1.5.1”项。连续5 d。第5天用药后1 h,每只小鼠腹腔注射0.6%醋酸0.2 mL,以引起扭体反应(腹部内凹,臀部高起),测定给药后10,15 min内小鼠扭体次数。

1.5.3 大鼠抗炎实验 有研究表明,高乌甲素对甲醛、佐剂、二甲苯等炎症模型有良好的的治疗效果[10,11]。大鼠佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA) 模型为灭活的结核分枝杆菌诱导的T细胞介导的免疫亢进性炎症模型[12,13],AA大鼠模型是成熟模型,也是研究类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)常用模型。RA发病过程与多种细胞因子有关,如非酶促因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α等[14,15]。RA患者体内TNF-α、IL-2水平上调,刺激内皮细胞产生黏附分子,黏附分子与白细胞作用,导致炎症反应更强烈,且刺激纤维母细胞增殖[16],影响生成骨细胞所需蛋白,从而破坏骨组织。降低TNF-α能减缓对软骨的破坏[17]。笔者在本实验通过大鼠AA实验考察高乌甲素脂质体凝胶抗炎效果。

取SPF 级Wistar雄性大鼠30只,体质量约200 g,在(24±2)℃、光照周期12 h环境适应性饲养1周。每只大鼠右后肢踝关节周围以记号笔做出环形标记,致炎前1 d用手术线绕足围一周测量足周长。每只大鼠右后足趾皮内注射弗氏完全佐剂0.1 mL以制备AA大鼠。第14天再次测量足围,与致炎前比较,增加0.5 cm即造模成功。将造模成功的大鼠以随机数字表法分为模型对照组、高乌甲素脂质体凝胶组、高乌甲素凝胶组。模型对照组大鼠右后足趾均匀涂布空白凝胶0.25 mL,其他两组分别涂布高乌甲素脂质体凝胶和高乌甲素凝胶0.25 mL,早晚各1次,均给药1周。

1.5.4 皮肤刺激性实验 取健康白兔8只,体质量2.0~2.5 kg,眼科手术剪背部对称脱毛2块,每块面积为5 cm×5 cm。分为完整皮肤组与破损皮肤组。破损皮肤组右侧用#400细砂纸在脱毛部位制备擦伤,使皮肤出现密集出血点。每只白兔左侧作为空白对照涂抹空白凝胶,完整皮肤组与破损皮肤组右测涂抹高乌甲素脂质体凝胶2.5 mL,24 h内涂药两次,涂完敷保鲜膜,胶带固定,24 h后洗去残留药物。

1.6 观察指标与观察方法

1.6.1 观察指标 体征:观察大鼠致炎后毛发、行为、足肿胀等变化;足围:致炎后每3~4 d同一时间、地点测量大鼠足围。治疗给药当天记录未给药时大鼠右后足周长,以后每隔2 d测量右后足周长,取第1,3,5,7天数据结果。生化指标:给药第7天禁食16 h,第8天经眼眶取血分离血清,酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定TNF-α、IL-2含量[16,18]。病理切片:麻醉后处死大鼠,剪下右后足炎性踝关节,小心剥离皮肤、肌肉组织,保留完整关节部分。甲醛固定,不同浓度梯度乙醇逐级脱水,石蜡包埋、切片(厚度4~7 μm)、进行苏木精-伊红(HE)染色,光学显微镜观察组织病理变化[19,20]。

1.6.2 皮肤刺激性评价标准 观察兔皮肤在洗去药物后1,24,48 h至第7天皮肤反应,按照表1进行评分。

表1 兔皮肤刺激性实验评价标准
Tab.1 Evaluation criteria for skin irritation test in rabbits
红斑 分值 平均分值 评价
无红斑 0 0.0~0.49 无刺激
极少数红斑 1 0.5~2.99 轻度刺激
中度红斑 2 3.0~5.99 中度刺激
大面积红斑 3 6.0~8.0 严重刺激
紫红色红斑并形成焦痂 4

表1 兔皮肤刺激性实验评价标准

Tab.1 Evaluation criteria for skin irritation test in rabbits

1.7 统计学方法

实验数据采用SPSS17.0版统计软件进行分析,计量资料以均数加减标准差($\bar{x}$±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用LSD-t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果
2.1 热板实验

见表2。给药前,3组小鼠痛阈值差异无统计学意义;高乌甲素凝胶组和高乌甲素脂质体凝胶组2,4 h痛阈值均大于同时间点空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);高乌甲素脂质体凝胶组2,4 h痛阈值大于高乌甲素凝胶组,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);给药后0.5 h,3组差异无统计学意义;给药后1 h,高乌甲素凝胶组和高乌甲素脂质体凝胶组高于空白对照组,高乌甲素凝胶组和高乌甲素脂质体凝胶组差异无统计学意义;给药后2,4 h,高乌甲素凝胶组与高乌甲素脂质体凝胶组痛阈分别提高34.3%和125.8%。由表2可知,随着给药时间延长,高乌甲素脂质体凝胶组痛阈值明显延长且明显大于高乌甲素凝胶组,提示脂质体凝胶有缓释作用。

表2 3组大鼠热板实验给药前后痛阈值测定结果
Tab.2 Results of pain threshold by hot plate test in three groups of rats before and after administration s, $\bar{x}$ s,n=10
组别 给药前痛阈 给药后0.5 h 给药后1 h 给药后2 h 给药后4 h
空白对照组 22.90±5.32 28.90±7.06 23.80±4.37 27.00±7.09 27.30±6.96
高乌甲素凝胶组 22.56±5.60 25.44±4.36 31.33±6.65*1 28.11±6.81*1 36.67±11.74* 1
高乌甲素脂质体凝胶组 21.09±3.91 27.64±7.20 29.64±8.30*1 38.73±15.45*1*2 61.64±28.34*3*4

与空白对照组比较,*1P<0.05,*3P<0.01;与高乌甲素凝胶组比较,*2P<0.05,*4P<0.01

Compared with blank control group,*1P<0.05,*3P<0.01;Compared with lappaconitine gel group,*2P<0.05,*4P<0.01

表2 3组大鼠热板实验给药前后痛阈值测定结果

Tab.2 Results of pain threshold by hot plate test in three groups of rats before and after administration s, $\bar{x}$ s,n=10

2.2 扭体实验

与空白对照组比较,给药后10,15 min,高乌甲素凝胶组、高乌甲素脂质体凝胶组扭体次数显著减少,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。给药后10 min内,高乌甲素凝胶组扭体次数少于高乌甲素脂质体凝胶组,差异无统计学意义;给药后15 min内,高乌甲素脂质体凝胶组扭体次数少于高乌甲素凝胶组,差异无统计学意义。见表3。

表3 3组小鼠给药前后扭体次数测定结果
Tab.3 Results of writhing times in three groups of mice before and after administration x¯±s,n=10
组别 10 min内扭体次数 15 min内扭体次数
空白对照组 22.00±8.49 39.6±13.0
高乌甲素凝胶组 9.54±9.43*1 21.0±16.2*2
高乌甲素脂质体凝胶组 11.70±9.01*2 18.0±13.6*1

与空白对照组比较,*1P<0.01,*2P<0.05

Compared with blank control group,*1P<0.01,*2P<0.05

表3 3组小鼠给药前后扭体次数测定结果

Tab.3 Results of writhing times in three groups of mice before and after administration x¯±s,n=10

2.3 抗炎实验

2.3.1 大鼠表现 致炎第2天,大鼠右后足掌整体明显红肿,足趾肿胀,足围及足厚度明显增加。见图1。致炎期间大鼠毛发光泽度差,行走轻微障碍,舔足次数增多。


图1 大鼠致炎后(A)与致炎前(B)足部对比图

Fig.1 Comparison of the toes of rats before (B) and after (A) inducing inflammatory

2.3.2 足围造模期间足围变化 见表4,给药前各组足围无明显差别。与造模前比较,造模第14天足围均增加>0.5 cm(P<0.01),提示造模成功。给药后每2~3 d测量足围,结果见表5。与模型对照组比较,高乌甲素凝胶组与高乌甲素脂质体凝胶组足围有变小趋势,且在第4天,高乌甲素脂质体凝胶组足围较模型对照组明显变小,差异有统计学意义(P<0.05);给药第7天,与模型对照组比较,高乌甲素凝胶组与高乌甲素脂质体凝胶组均差异有统计学意义(P<0.01),且高乌甲素脂质体凝胶组足围小于高乌甲素凝胶组(P<0.01)。

表4 3组大鼠造模期间足围变化
Tab.4 Changes of toe circumference in three groups of rats during modeling $\bar{x}$±s,n=10,cm
组别 造模前 造模第4天 造模第7天 造模第10天 造模第14天
模型对照组 2.191±0.085 2.762±0.137 2.808±0.098 2.771±0.073 2.825±0.080
高乌甲素凝胶组 2.188±0.056 2.841±0.191 2.919±0.182 2.778±0.083 2.787±0.099
高乌甲素脂质体凝胶组 2.193±0.054 2.822±0.335 2.859±0.122 2.865±0.125 2.819±0.094

表4 3组大鼠造模期间足围变化

Tab.4 Changes of toe circumference in three groups of rats during modeling $\bar{x}$±s,n=10,cm

表5 3组大鼠给药前后足围变化
Tab.5 Changes of toe circumference in three groups of rats after administration $\bar{x}$±s,n=10,cm
组别 给药前 给药后第2天 给药后第4天 给药后第7天
模型对照组 2.825±0.080 2.752±0.045 2.734±0.027 2.774±0.047
高乌甲素凝胶组 2.787±0.099 2.722±0.111 2.670±0.100 2.638±0.091*1
高乌甲素脂质体凝胶组 2.819±0.094 2.703±0.068 2.645±0.041*2 2.554±0.042*1*3

与模型对照组比较,*1P<0.01,*2P<0.05;与高乌甲素凝胶组比较,*3P<0.01

Compared with model control group,*1P<0.01,*2P<0.05; Compared with lappaconitine gel group,*3P<0.01

表5 3组大鼠给药前后足围变化

Tab.5 Changes of toe circumference in three groups of rats after administration $\bar{x}$±s,n=10,cm

表6 3组大鼠血清TNF-α和IL-2测定结果
Tab.6 Determination of serum TNF-α and IL-2 in three groups of rats pg·mL-1, $\bar{x}$±s,n=10
组别 TNF-α IL-2
模型对照组 234.64±28.44 36.01±4.67
高乌甲素凝胶组 187.34±23.92*1 31.80±4.34*1
高乌甲素脂质体凝胶组 156.07±16.28*2*3 27.89±2.91*2*3

与模型对照组比较,*1P<0.05,*2P<0.01;与高乌甲素凝胶组比较,*3P<0.05

Compared with model control group,*1P<0.05,*2P<0.01; Compared with lappaconitine gel group,*3P<0.05

表6 3组大鼠血清TNF-α和IL-2测定结果

Tab.6 Determination of serum TNF-α and IL-2 in three groups of rats pg·mL-1, $\bar{x}$±s,n=10

2.3.3 血清生化指标 ELISA法测得标准曲线值,经软件计算得到TNF-α:Y=0.000 2X+0.011 0,r=0.996 1;IL-2:Y=0.000 7X+0.004 1,r=0.994 2,酶标仪测得吸光度值(A)值,代入公式后得到血清中大鼠TNF-α、IL-2浓度(pg·mL-1),结果见表6。造模21 d后高乌甲素凝胶组与高乌甲素脂质体凝胶组TNF-α、IL-2浓度较模型对照组下降,且差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与高乌甲素凝胶组比较,高乌甲素脂质体凝胶组TNF-α与IL-2浓度显著降低(P<0.05)。

2.3.4 踝关节病理切片 见图2。放大相同倍数,可见模型对照组切片关节腔狭窄,滑膜组织增生、充血且伴有大量炎细胞浸润,结缔组织增生,出现较多血管翳,软骨破坏明显。与模型对照组与高乌甲素凝胶组比较,高乌甲素脂质体凝胶组关节腔较宽,结缔组织排列较规则,炎细胞浸润减轻。提示高乌甲素脂质体凝胶抗炎效果更好。


图2 3组大鼠踝关节病理特征(HE,×200)

Fig.2 Pathology of ankle joint in three groups of rat(HE,×200)

2.4 家兔皮肤刺激实验

按照评分标准,皮肤给药后1~7 d,兔完整与破损皮肤评分为0,均未出现刺激红肿现象。

3 讨论

小鼠热板实验中,2 h后高乌甲素脂质体凝胶组痛阈值较高乌甲素凝胶显著提高;扭体实验中高乌甲素凝胶组与高乌甲素脂质体凝胶组差异无统计学意义;佐剂实验发现,高乌甲素脂质体凝胶能显著降低血清TNF-α、IL-2含量。以上实验证明,在同等剂量下,随着给药时间的延长,高乌甲素脂质体凝胶镇痛抗炎效果明显强于高乌甲素凝胶,且脂质体可滞留于皮肤,增加药物在皮肤中的含量,从而形成释药储库,使高乌甲素脂质体达到缓释效果。以兔完整与破损皮肤刺激实验对高乌甲素脂质体凝胶进行安全性评价,显示该药温和无刺激。

实验过程中应注意,卡波姆放置时长链舒展引起pH值下降,使用时需测定pH值并用三乙醇胺调节pH值为6.5~6.8。小鼠用硫化钠脱毛后,需用0.9%氯化钠溶液清洗皮肤并恢复1 d再给药,防止对皮肤造成的损伤影响药物吸收。涂抹药物过程中小鼠易舔食药物,因此应待药物充分吸收后再放入饲养箱,大鼠足部抹药时用纱布与医用胶布包裹,以免其舔食。

本实验证实,高乌甲素脂质体凝胶有一定疗效且有缓释效果,但其体内分布及代谢情况需进一步研究。佐剂关节实验证实,高乌甲素能下调TNF-α、IL-2,从而发挥抗炎效果,这为研究高乌甲素抗炎作用机制提供了基础。脂质体凝胶剂为近年研究的热点,能提高药物局部浓度,增加药物的稳定性,改善患者顺应性,受到研究者青睐。本实验结果可为高乌甲素脂质体制剂的开发提供新思路。

The authors have declared that no competing interests exist.
参考文献
[1] GUO T,ZHANG Y T,ZHAO J H,et al.Nanostructured lipid carriers for percutaneous administration of alkaloids isolated from Aconitum sinomontanum[J].J Nanobiotechnol,2015,13:47.
Background Lipid-based nanosystems have great potential for transdermal drug delivery. In this study, nanostructured lipid carriers (NLCs) for short-acting alkaloids lappacontine (LA) and ranaconitine (RAN) isolated from Aconitum sinomontanum (AAS) at 69.47 and 9.16% (w/w) yields, respectively, were prepared to enhance percutaneous permeation. Optimized NLC formulations were evaluated using uniform design experiments. Microstructure and in vitro/in vivo transdermal delivery characteristics of AAS-loaded NLCs and solid lipid nanoparticles (SLNs) were compared. Cellular uptake of fluorescence-labeled nanoparticles was probed using laser scanning confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting. Nanoparticle integrity during transdermal delivery and effects on the skin surface were also investigated. Results NLC formulations were less cytotoxic than the AAS solution in HaCaT and CCC-ESF cells. Moreover, coumarin-6-labeled NLCs showed biocompatibility with HaCaT and CCC-ESF cells, and their cellular uptake was strongly affected by cholesterol and lipid rafts. Significantly greater cumulative amounts of NLC-associated LA and RAN than SLN-associated alkaloids penetrated the rat skin in vitro. In vivo microdialysis showed higher area under the concentration???time curve (AUC) 0???t for AAS-NLC-associated LA and RAN than for AAS-SLN-associated alkaloids. Conclusions NLC formulations could be good transdermal systems for increasing biocompatibility and decreasing cytotoxicity of AAS. AAS-NLCs showed higher percutaneous permeation than the other preparations. These findings suggest that NLCs could be promising transdermal delivery vehicles for AAS.
DOI:10.1186/s12951-015-0107-3      PMID:4496826      URL    
[本文引用:1]
[2] 李思思,张洪兵,朱雪瑜.高乌甲素新型制剂的研究进展[J].现代药物与临床,2014,29(7):818-823.
Lappaconitine is a kind of diterpenoid alkaloids extracted from Aconitum sinomontanum Nakai. As a non-opioid analgesic, its hydrobromide is commonly used in the treatment of moderate to severe pain clinically. The clinical application of lappaconitine traditional preparations was limited due to its poor water solubility and sensitivity to light, which made the study of new agents become a trend. In recent years, different formulations of lappaconitine are constantly developed to meet different therapeutic purposes. Research progress on new preparations of lappaconitine was reviewed in recent years. And the information was classified and summarized mainly from three aspects of carrier, sustained-release and immediate-release preparations, to analyse the existing problems and provide some references for further study.
DOI:10.7501/j.issn.1674-5515.2014.07.028      Magsci     URL    
[本文引用:1]
[3] 孟莹,郭欣,柳阳,等.苯海拉明凝胶剂的制备及体外释药特性考察[J].医药导报,2018,37(7):889-892.
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[4] 王鹏,杨秀丽,羊波,等.紫杉醇脂质体凝胶剂的制备及镇痛抗炎作用[J].中国现代应用药学,2015,32(3):281-285.
目的 制备紫杉醇脂质体凝胶剂,对其镇痛抗炎作用进行初步研究。方法 薄膜分散法制备紫杉醇脂质体,用透射电镜观测其形态,用激光纳米粒度仪测定粒径大小及分布,用HPLC测定其包封率。脂质体进一步制成凝胶剂后,体外透皮实验测定其不同时间的体外透皮量,考察其体外透皮情况。大鼠角叉菜胶致足肿胀模型及小鼠甲醛致痛模型,考察紫杉醇脂质体凝胶剂的镇痛抗炎作用。结果 制得的紫杉醇脂质体形态规则、分布均匀,平均包封率为（73.6±0.3）%（n=3）,所得凝胶呈半透明状;体外透皮实验中,紫杉醇脂质体凝胶剂符合一级动力学方程,起到较好的缓释作用。抗炎实验中,与模型组比较,各给药组在一定时间内均能显著性减轻致炎足趾的肿胀程度（P〈0.05）,并呈现明显的量效关系。甲醛致痛实验中,给药组与模型组比较,小鼠舔足次数明显减少（P〈0.05）。结论 紫杉醇脂质体凝胶具有明显镇痛抗炎作用。
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[5] 魏华波,张宝华,谭兵,等.氢溴酸高乌甲素的药理作用及临床应用研究进展[J].重庆医学,2014,43(20):2660-2662.
氢溴酸高乌甲素（lappaconitine ，LA）是国内首创的非成瘾性中枢镇痛药，因其镇痛作用强而无成瘾性、无蓄积现象和毒副作用轻而广泛应用于临床各种疼痛，如胃肠溃疡、胃炎、胆囊炎、风湿病、坐骨神经痛、牙痛、术后疼痛、癌痛等。研究发现LA除了具有强镇痛作用，还具有抗炎消肿、抗心律失常、抗癫痫、抗风湿、抗氧化、抗肿瘤、抗细菌、降温解热、局部麻醉和免疫调节等作用［1-3］。随着临床的大量应用发现，L A可引起严重过敏反应、致唾液腺肿大、心律不齐、传导阻滞、甚至心室颤动和耳毒性等不良反应，为临床的应用带来了困惑。本文就LA的药理作用、临床应用、不良反应及注意事项进行了综述。
DOI:10.3969/j.issn.1671-8348.2014.20.044      URL    
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[6] 李芸,苗小楼,吴平安,等.高乌头炮制前后镇痛作用比较及生物碱含量测定[J].中兽医医药杂志,2015,(4):36-39.
目的:比较高乌头生品和炮制品的镇痛作用及其中总生物碱与高乌甲素的含量。方法:采用小鼠热板法和扭体法对高乌头炮制前后的镇痛作用进行研究;分别采用酸性染料比色法和高效液相色谱法测定样品中总生物碱和高乌甲素的含量。结果:在扭体法实验中,高乌头炮制前后的镇痛率分别为16.84%和50.52%,炮制品明显高于生品,但无统计学意义;在热板法实验中,给药后30 min、45 min、60 min,高乌头生品及炮制品的痛阈提高百分率分别为37.78%、74.34%、109.05%及76.04%、111.59%、111.13%,与正常对照组比较差异显著(P0.05),但炮制品与生品比较差异不显著。高乌头炮制前后总生物碱和高乌甲素的质量分数分别为2.06%、7.75%和1.170%、0.596%。结论:高乌头炮制后镇痛作用增强,表明以甘草汁炮制能够增强高乌头的镇痛作用,且是通过增加总生物碱的含量,而不是增加高乌甲素的含量而达到增效作用。
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[本文引用:1]
[7] ZHU X C,GE C T,WANG P,et al.Analgesic effects of lappaconitine in leukemia bone pain in a mouse model[J].Peer,2015,3:e936.
Bone pain is a common and severe symptom in cancer patients. The present study employed a mouse model of leukemia bone pain by injection K562 cells into tibia of mouse to evaluate the analgesic effects of lappacontine. Our results showed that the lappaconitine treatment at day 15, 17 and 19 could effectively reduce the spontaneous pain scoring values, restore reduced degree in the inclined-plate test induced by injection of K562 cells, as well as restore paw mechanical withdrawal threshold and paw withdrawal thermal latency induced by injection of K562 cells to the normal levels. Additionally, the molecular mechanisms of lappaconitine analgesic effects may be related to affect the expression levels of endogenous opioid system genes (POMC, PENK and MOR), as well as apoptosis-related genes (Xiap, Smac, Bim, NF-B and p53). Our present results indicated that lappaconitine may become a new analgesic agent for leukemia bone pain management.
DOI:10.7717/peerj.936      PMID:26019998      URL    
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[8] 丛茜玉,王晓敏,周志愉,等.白芍总苷对应激大鼠的行为和下丘脑神经内分泌的影响[J].医药导报,2018,37(1):16-19.
目的观察白芍总苷对应激大鼠行为和神经内分泌的影响,探讨其部分作用机制。方法雄性SD大鼠取10只作为正常对照组,其余40只采用不可预见性中等刺激建立应激大鼠模型,随机分为模型对照组、氟西汀(5.0mg·kg-1)组和白芍总苷大、小剂量(66,33mg·kg-1)组,每组10只。连续给药3周后,使用自主活动仪测定大鼠水平和垂直活动变化;采用悬尾实验观察大鼠情绪变化;采用苏木精-伊红染色观察肾上腺形态学变化,放射免疫法测定皮质酮和促肾上腺皮质激素(ACTH)的含量,实时聚合酶链反应(RTPCR)法检测下丘脑促肾上腺皮质素释放激素(CRH)mRNA的表达。结果与模型对照组比较,白芍总苷大剂量组水平和垂直活动增加(P<0.05);不动时间减少(P<0.05),肾上腺指数下降,血清皮质酮和ACTH下降(P<0.05);下丘脑CRHmRNA的表达下降(P<0.05)。结论白芍总苷能纠正应激大鼠行为和内分泌紊乱,可能是通过降低皮质酮水平和下丘脑CRHmRNA的表达,调整紊乱的下丘脑-垂体-肾上腺轴活动实现。
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[9] 肖智,张福安,张兰英.高乌甲素在大鼠中脑导水管周围灰质的镇痛机制[J].基础医学与临床,2014,34(3):324-327.
ObjectiveTo investigate the analgesic effect of lappaconitine (LA) on burned rats and its supraspinal analgesic mechanism. MethodsMale Sprague-Dawley rats were divided into 6 groups: normal, burn, burn LA，burn LA plus antisense oligodeoxynucleotide (A-ODN)，burn LA plus A317491 and burn LA plus ATP. The later 4 groups had LA (6mg/kg) administered intraperitoneally. The pain threshold was characterized by the mechanical withdrawal threshold (MWT) testing; The expression of P2X3 receptor protein in the midbrain periaqueductal gray (PAG) was assessed by Western blot analysis. Observation the intra-PAG injection of P2X3 A-ODN, selective antagonist and agonist of P2X3 receptor on the analgesic effect of LA. ResultsIn burn group, the MWT was decreased while increased in burn LA group. LA induced a significantly up-regulated P2X3 receptor protein expression in PAG. The antinociceptive effect of LA was attenuated significantly by P2X3 A-ODN. The α,β-meATP or A317491 significantly enhanced or attenuated analgesic effect of LA, respectively. Conclusions LA produces an antinociceptive effect on burn pain via increases expression and function of P2X3 receptors in the PAG.
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[10] 刘铭佩,鞠洋,党月兰.高乌甲素的抗炎作用[J].中药药理与临床,2004,20(4):13-15.
目的:研究高乌甲素的抗炎作用.方法:采用多种致炎剂引起大、小鼠炎症模型进行实验.结果:高乌甲素对二甲苯、角叉菜胶、甲醛、完全弗氏佐剂致肿及琼脂肉芽肿增生均有明显抑制作用.结论:高乌甲素具有抗急、慢性炎症作用.
DOI:10.3969/j.issn.1001-859X.2004.04.007      URL    
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[11] 黄维艳,欧珊.氢溴酸高乌甲素在镇痛的研究进展[J].中华卫生应急电子杂志,2016,2(6):377-381.
高乌甲素(lappaconitine,LA)又名刺乌头碱、拉巴乌头碱,是从毛茛科植物高乌头的根中提取分离的生物碱,属C18型二萜类,其临床应用的主要剂型是氢溴酸高乌甲素.研究表明,高乌甲素镇痛、抗炎、消肿、解热等作用显著,同时还具有无成瘾性和不良反应少等优点[1-4].作为一种中药类的镇痛剂,随着对其药理机制和临床研究的日益深入高乌甲素受到了医药界越来越广泛地关注[5].本文从来源、药理作用、基础与临床应用以及药物不良反应等方面对高乌甲素的研究进展进行综述.乌头是我国的传统中药,乌头根又称为炮附子,在中国和日本民间常将乌头根煎服用于祛风除湿、活血祛瘀、温里散寒、止痛[6].1978 年西北师范学院韦璧瑜发现高乌头有效成分为LA[7].1980年,陈泗英等[8]率先从高乌头中单独分离出 LA.唐希灿[9]、王锐[10]、马晓强[11]等又分别从赣乌头、甘肃狭盔高乌头和滇西乌头中分离出LA.
DOI:10.3877/cma.j.issn.2095-9133.2016.06.009      URL    
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[12] 孙晓静,徐澍,贾晓益,等.大鼠佐剂性关节炎病程不同阶段T细胞亚群及重要器官的病理学变化[J].中国药理学通报,2015,31(4):475-481.
目的观察大鼠佐剂性关节炎(adjuvant rheumatoid arthritis,AA)病程不同阶段的脾脏T细胞亚群及其重要器官的病理学变化,探讨病程不同的阶段AA大鼠T细胞亚群变化的规律及局部组织和全身重要器官的病理学变化特点。方法选用20只♂Lewis大鼠,完全弗氏佐剂(CFA)诱导AA模型,造模后d 7、d 10、d 13、d 16、d 19、d 22进行全身评分和关节炎指数评分,计算关节肿胀数。造模后d 14(炎症初期)、d 22(炎症高峰期)处死大鼠,流式细胞仪检测炎症初期和炎症高峰期脾脏总T细胞(CD3+CD4+)、记忆T细胞(CD4+CD44+)、未致敏T细胞(CD4+CD62L+)的细胞亚群和Th17(CD4+IL-17+)细胞亚群比例。d 22取心、肝、脾、肺、肾、踝关节、肠系膜淋巴结组织,光镜观察各组织的病理学改变。结果大鼠免疫后10 d出现继发侧足爪红肿,炎症初期(d 10~d 14)和炎症高峰期(d 19~d 22)AA大鼠的全身评分、关节炎指数评分和关节肿胀数有不同程度的增加。踝关节病理见滑膜组织增生、炎细胞浸润,血管翳出现等,且心、肝、脾、肺、肾、肠系膜淋巴结组织的病理也有不同程度的炎性变化。与正常组比较,炎症初期AA大鼠脾脏总T细胞、记忆T细胞和未致敏T细胞亚群比例都无明显变化、炎症高峰期AA大鼠脾脏总T细胞、记忆T细胞和未致敏T细胞亚群比例明显升高;Th17细胞亚群比例在炎症初期和高峰期都明显升高。结论 AA大鼠的T细胞亚群在炎症初期和高峰期出现不同的变化特点;在大鼠AA不仅有关节局部的病理表现,且全身主要脏器组织均有受累。
DOI:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.008      URL    
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[13] 赵勤,王乐乐,魏立鹏,等.麻花秦艽醇提物对佐剂性关节炎大鼠的影响[J].中药药理与临床,2015,31(1):145-147.
目的:研究麻花秦艽醇提物对佐剂性关节炎大鼠的影响。方法:取大鼠48只,随机分为6组:正常对照组、佐剂性关节炎模型组、麻花秦艽醇提物组(10、5、2.5g/kg)和雷公藤多甙(10mg/kg)组。除正常对照组外,各组大鼠左后足皮内注射Freunds完全佐剂致大鼠佐剂性关节炎模型,灌胃给药21天,观察对佐剂性关节炎大鼠原发性病变和继发性足肿胀的影响。结果:麻花秦艽醇提物(10、5、2.5g/kg)对佐剂性关节炎大鼠原发性和继发性病变足肿胀均有明显的抑制作用,对大鼠体重增长缓慢有一定的改善作用,且不影响胸腺和脾脏指数。结论:麻花秦艽醇提物有改善佐剂性关节炎病理模型的作用,为其临床治疗类风湿关节炎提供了药理学依据。
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[14] LIU W,SUN Y,CHENG Z,et al.Crocin exerts anti-inflammatory and anti-arthritic effects on type II collagen-induced arthritis in rats[J].Pharmaceut Biol,2018,56(1):209-216.
Abstract CONTEXT: Rheumatoid arthritis (RA) is a common systemic auto-immune disease, which is characterized by chronic and symmetry synovial inflammation. Crocin has been reported to exhibit anti-inflammatory effects in animal models. OBJECTIVE: This study investigates the anti-inflammatory and anti-arthritic effects of crocin on type II collagen-induced arthritis (CIA) in Wistar rats. MATERIALS AND METHODS: The CIA rat model was established and randomly divided into five groups with or without crocin treatment (10, 20 or 40090009mg/kg), which was started on day 21 after arthritis induction and persisted for 360002days. The symptoms and molecular mechanisms of CIA and crocin-treated CIA rats were compared and investigated. RESULTS: CIA rats presented severe RA symptoms, including high arthritis score, paw swelling, joint inflammation, bone erosion, chondrocyte death, cartilage destruction, enhanced expressions of matrix metalloproteinase (MMP) and pro-inflammatory cytokines. However, crocin could mitigate these symptoms. Crocin (40090009mg/kg) exhibited the most efficient therapeutic function on CIA rats: the histological scores of joint inflammation, bone erosion, chondrocyte death, cartilage surface erosion, and bone erosion of CIA rats receiving 40090009mg/kg crocin treatment were comparable to the normal rats. MMP-1, -3 and -13 protein expression levels of CIA rats with 40090009mg/kg crocin treatment were decreased to levels similar to normal rats. Moreover, crocin could also inhibit the expression of TNF-02±, IL-17, IL-6 and CXCL8 in serum and ankle tissues of CIA rats. CONCLUSIONS: In summary, crocin exhibits therapeutic potential for RA, by mitigating the symptoms and inhibiting the pro-inflammatory factor expression.
DOI:10.1080/13880209.2018.1448874      PMID:29540097      URL    
[本文引用:1]
[15] 卢军,任景,王晓波,等.中药复方配合针灸对佐剂性关节炎模型大鼠血清IL-1、IL-2及TNF-α水平的影响[J].新疆中医药,2013,31(3):59-60.
目的观察针灸合并中药复方对佐 剂性关节炎模型大鼠血清COR、IL-1β及TNF-α水平的影响,探讨中药及针药结合治疗类风湿性关节炎的作用及机制。方法雄性SD大鼠50只随机分为 5组,除正常组10只外,其余各组应用完全弗氏佐剂诱导大鼠关节炎,给药及针药结合治疗28天后,测定大鼠足肿胀体积并检测IL-1IL-2及TNF-α 水平。结果与模型组比较,各组均能降低大鼠足肿胀体积(P0.01),大鼠血清IL-1、TNF-α水平明显降低,IL-2水平明显升高(P0.01)。 结论实验表明各治疗组对佐剂性关节炎模型大鼠足肿胀有一定的改善作用,但各治疗组之间无统计学差异(P0.05)。其作用机制可能与免疫及炎性细胞因子调 节有关。
DOI:10.3969/j.issn.1009-3931.2013.03.031      URL    
[本文引用:1]
[16] 胡建楣,肖柳英,潘竞锵,等.高乌甲素抑制佐剂性关节炎大鼠模型的实验研究[J].中药材,2009,32(3):420-422.
目的：研究高乌甲素对大鼠佐剂性关节炎模型的影响。方法：将大鼠随机分为空白对照组、模型 组，地塞米松阳性对照组、高乌甲素高、中、低剂量组。将大鼠足跖注射Freund’s完全佐剂形成佐剂性关节炎（AA），观察各组大鼠炎症左右足跖厚度、 血清肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-2（IL-2）和循环免疫复合物（CIC）的含量变化。结果：与模型组比较，注射佐剂的大鼠右后跖从第2天 开始肿胀持续15d（原发性损害），高乌甲素可抑制大鼠足肿胀程度，能降低大鼠血清TNF—α、IL-2、CIC和PGEa含量而发挥抗炎作用。结论：高 乌甲素及地塞米松具有抗佐剂性关节炎（AA）及降低致炎因子和相关炎症介质的作用。
DOI:10.1016/S1874-8651(10)60073-7      URL    
[本文引用:2]
[17] 李可大. 免疫调节和前炎性因子(TNF-α)在类风湿性关节炎中的作用与意义[J].中医药学刊,2004,22(10):1844-1846.
TNF-α是一种主要的免疫调节和前炎性因子,因其在RA中的表 现上调而被认为在其病理机制中发挥重要作用.在RA中TNF-α主要产生于RA滑膜中的滑膜巨噬细胞并刺激纤维母细胞增殖及淋巴细胞的活性.TNF-α生 成的过程始于配体和细胞表面钟形(Toll)受体结合,刺激信号转导通路而激活NF-κB转录因子.被激活的NF-κB进入细胞核并诱导与炎症有关基因的 转录,包括TNF的编码.TNF和其它炎性细胞因子的生成又募集其它炎性细胞依次释放细胞因子进而放大免疫反应.TNF是通过结合TNFR1和TNFR2 受体而发挥作用的.许多实验及临床研究均证实阻滞TNF-α活性对治疗RA有效.TNF-α和IL-1抑制剂的临床应用很好的说明了细胞因子在RA中的作 用.其作用机制在体内是复杂的,可能是抑制了其它前炎性细胞因子,减低滑膜细胞浸润,介入破骨细胞活化,阻止血管生成.TNF-α抑制剂可以减缓或阻止 PA骨和软骨的进行性损害.这可能与其抑制破骨细胞的作用有关.Etanercept(可溶性TNF-α受体融化蛋白)、Infliximab(抗 TNF-α嵌合型[人/鼠]单克隆抗体)和adalimumab(抗TNF-α人单克隆抗体)三种生物制剂是目前临床研究的热点.
DOI:10.3969/j.issn.1673-7717.2004.10.031      URL    
[本文引用:1]
[18] 赵春颖,刘永平,马帅,等.赤雹根总皂苷对佐剂关节炎大鼠血清及足TNF-α,IL-1β,IL-6水平的影响[J].中药药理与临床,2015,31(2):34-38.
目的:观察赤雹根总皂苷对佐剂型关节炎大鼠血清及足跖中肿瘤坏死因子-α、白介素-1β、白介素-6(TNF-α,IL-1β,IL-6)表达水平的影响,探讨赤雹根总皂苷治疗类风湿性关节炎的机制。方法:雄性SD大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、赤雹根总皂苷40、80、160 mg/kg剂量组和雷公藤多苷12mg/kg阳性对照组。除正常对照组外,其余各组大鼠均于右后足跖部皮下注射完全弗氏佐剂0.1ml。造模18天后,各给药组均灌胃给予相应药物,连续21天。计算大鼠关节炎指数,酶联免疫法(ELISA)检测大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平,免疫组织化学法测定足跖以上三种因子蛋白表达水平。结果:赤雹根总皂苷剂量40、80、160mg/kg组大鼠关节炎指数分别为6.00±0.40、5.10±0.18、4.20±0.32均显著低于模型对照组7.20±0.32;血清中TNF-α水平分别为0.56±0.05、0.32±0.04、0.18±0.04 ng/ml均显著低于模型对照组0.98±0.08 ng/ml,IL-1β水平分别为0.29±0.02、0.17±0.01、0.13±0.01 ng/ml均显著低于模型对照组0.49±0.01ng/ml,IL-6水平分别为1.13±0.03、0.95±0.01、0.79±0.06 ng/ml均显著低于模型对照组1.58±0.04ng/ml;足跖中TNF-α蛋白表达水平分别为1.09±0.27、0.61±0.13、0.57±0.11 IOD均显著低于模型对照组2.17±0.34,IL-1β蛋白表达水平分别为1.13±0.32、0.65±0.22、0.63±0.24 IOD均显著低于模型对照组2.23±0.46IOD,IL-6蛋白表达水平分别为1.31±0.29、0.59±0.21、0.45±0.17 IOD均显著低于模型对照组2.49±0.38 IOD。结论:抑制TNF-α、IL-1β、IL-6水平及表达是赤雹根总皂苷治疗佐剂型关节炎的机制之一。
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[本文引用:1]
[19] 莫海珊,周毅生,黄叶东,等.龙须藤总黄酮对佐剂关节炎大鼠的治疗作用及机制[J].中成药,2017,39(3):593-596.
目的探讨龙须藤总黄酮对佐剂关节炎(AA)动物模型的治疗作用。方法于大鼠左后足跖皮内注射完全弗氏佐剂建立佐剂关节炎大鼠模型,以多发性关节炎指数评分、继发侧关节肿胀度、踝关节病理切片为指标,观察龙须藤总黄酮对佐剂关节炎大鼠的影响。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含有量,初步探讨龙须藤总黄酮抗佐剂关节炎的作用机制。结果与模型组相比,龙须藤总黄酮各组均能不同程度地使佐剂关节炎大鼠关节炎指数、继发性足肿胀度下降,并显著降低大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含有量。结论龙须藤总黄酮对佐剂关节炎大鼠具有治疗作用,其抗炎机制可能与其抑制IL-1β、IL-6和TNF-α分泌有关。
DOI:10.3969/j.issn.1001-1528.2017.03.032      URL    
[本文引用:1]
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徐蕾
杨爱霞
肖卫红
XU Lei
YANG Aixia
XIAO Weihong