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医药导报
医药导报, 2016, 35(9): 987-990
doi: 10.3870/j.issn.1004-0781.2016.09.020
不同采收期半枝莲中黄酮含量比较*
Comparison of Flavonoids Contents in Scutellaria Barbata D.Don from Different Harvest Time
范菊娣1,, 覃容贵1, 李相陵2, 王世清3, 朱玉梅3, 杨传玉1
1.贵州医科大学药学院,贵阳 550004
2.贵州医科大学医药卫生管理学院,贵阳 550004
3.贵州中医学院药学院,贵阳 550001
FAN Judi1, QIN Ronggui1, LI Xiangling2, WANG Shiqing3, ZHU Yumei3, YANG Chuanyu1
1.College of Pharmacy, Guizhou Medical University, Guiyang 550004,China
2. College of Medicine Management, Guizhou Medical University, Guiyang 550004,China
3. School of Pharmacy, Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550001,China

作者简介 范菊娣(1974-),女,贵州锦屏人,副教授,硕士,从事中药质量相关研究。电话:0851-86908318,E-mail:lfanjudi@163.com。
基金资助: 贵州省科技厅中药开发专项(黔科合[2012]5001-4号)
中图分类号: R282.71;R927.2     文献标识码: B     文章编号: 1004-0781(2016)09-0987-04
摘要:

目的 以黄酮类含量为指标,确定半枝莲药材的最佳采收期。方法 以野黄芩苷为对照品,采用紫外-可见分光光度法测定不同采收期半枝莲中总黄酮含量,采用高效液相色谱(HPLC)法测定其中野黄芩苷及大波斯菊的含量。结果 不同采收期的半枝莲中总黄酮和野黄芩苷的含量均达到了《中华人民共和国药典》的规定标准,在开花期半枝莲的总黄酮和野黄芩苷的含量最高,其中总黄酮的平均含量(45.74±0.95) mg·g-1,野黄芩苷的平均含量(5.58±0.16) mg·g-1,大波斯菊苷的平均含量(17.39±0.42) mg·g-1。结论 半枝莲药材的最佳采收期应为枝繁叶茂的开花期。
关键词: 半枝莲 ; 黄酮 ; 分光光度法,紫外-可见 ; 色谱法,高效液相 ; 采收期

Abstract:

Objective To determine the optimum harvest time of Scutellaria barbata D.Don with flavonoids contents as the index. Methods The content of total flavonoids in Scutellaria barbata D.Don was determined by ultraviolet-visible spectrophotometry with scutellarin as standard control, and scutellarin and cosmosiin in Scutellaria barbata D.Don were determined by HPLC. Results The contents of total flavonoids and scutellarin in Scutellaria barbata D.Don of different harvest time were complied with the quality standards in the China Pharma Copoeia, and reached the peakin blossom . The contents of total flavonoids, scutellarin and cosmosiin were (45.74±0.95) ,(5.58±0.16 ) and (17.39±0.42) mg·g-1, respectively. Conclusion The Scutellaria Barbata D.Don may be collected at the flowering time with luxuriant foliage.
Key words: D.Don ; Flavonoids ; Spectrophotometry, ultraviolet-visible ; Chromatography, high performance liquid ; Harvest time

半枝莲(Scutellaria barbata D.Don)为唇形科黄芩属植物,又名狭叶韩信草、并头草、四方马兰等,生长于池沼边、田边或路旁湿润处,广泛分布于我国的大部分地区,主产于贵州、广西、四川、河南等地。其性味辛、苦、寒,归肺、肝、肾经,以干燥全草入药[1],具有抑菌、抗病毒作用,可用于肿瘤、肝炎、肾炎等治疗[2-6]。半枝莲含有多种黄酮、多糖等成分,2010年版《中华人民共和国药典》规定野黄芩苷和总黄酮含量为半枝莲药材的检测指标。半枝莲中大波斯菊苷为黄酮类成分[7-8],含量丰富,对总黄酮富集变化有较大贡献,故把大波斯菊苷含量纳入检测指标。

半枝莲易种易管,一次种植可连续采收,在南方各省一年收割3或4次,但是不同年限栽培品间质量参差不齐,临床疗效有较大差异。为进一步探索半枝莲药材的最佳采收期及收割次数是否对其有影响,从而更好保证半枝莲药材的质量,笔者选择产于贵州省贵阳市乌当区新堡乡陇上村仿野生抚育基地半枝莲的地上部分作为研究对象,测定药材中野黄芩苷及大波斯菊苷的含量,以期为仿野生抚育基地半枝莲最佳采收期的确定提供实验依据。

1 仪器、试剂及材料
1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱(HPLC)仪(DAD检测器,Agilent Chemstation色谱工作站);紫外-可见分光光度计(UV-2401PC,日本岛津公司);植物粉碎机(FZ-102型河北黄骅县齐家务科学仪器厂);标准检验筛(浙江上虞市道墟张兴纱筛厂,孔径0.250 mm);水浴锅(DK-98-11,天津市秦斯特仪器有限公司);电子天平(XS205,梅特勒·托利多公司,感量:0.01 mg)。

1.2 试剂

甲醇、冰醋酸(天津市科密欧化学试剂开发中心 ),水(娃哈哈纯净水),其他试剂为分析纯;野黄芩苷对照品(批号:110842-201207,中国食品药品检定研究院提供);大波斯菊苷对照品(2013年10月由扬州大学生物科学与技术学院天然产物化学实验室提供,含量>98%)。

1.3 材料

半枝莲药材采自贵州省贵阳市乌当区新堡乡陇上村,由贵阳医科大学药学院生药学教研室覃容贵教授鉴定为唇形科植物半枝莲(Scutellaria barbata D.Don)的干燥地上部分。标本放置于药学院生药学教研室。采收期每10 d采收1次,采摘后50 ℃烘箱干燥粉碎装入塑料封口袋备用。

2 方法与结果
2.1 总黄酮的含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 取干燥至恒质量的野黄芩苷对照品2.0 mg,精密称定,置于10 mL量瓶中,甲醇溶解定容,制成每毫升含200 μg的溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取半枝莲样品粉末约1 g(过筛),精密称定,用滤纸包裹置于索氏提取器中,加入石油醚80 mL,提取至无色,取出滤纸包晾干;将滤纸包重新置于索氏提取器中,加入甲醇80 mL,回流提取至无色,将提取液以甲醇定容至100 mL得样品溶液。精密吸取上述样品溶液1 mL,甲醇定容至50 mL,即得供试品溶液。

2.1.3 测定波长的确定 按《中华人民共和国药典》(2010年版)半枝莲项下总黄酮含量测定方法,以甲醇为空白对照,采用紫外-可见分光光度法,在波长335 nm处测定吸光度(A)[1]。

2.1.4 标准曲线绘制 精密量取野黄芩苷对照品溶液0.4,0.8,1.2,1.6,2.0 mL,分别置25 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀。以甲醇为空白,在紫外波长335 nm处扫描,测定A;以A为纵坐标,浓度(C)为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程为:A=41.153C+0.008 9(r=0.999 7),野黄芩苷标准溶液浓度在3.2~16.0 μg·mL-1范围内具有良好的线性关系。

2.1.5 精密度实验 精密量取同一野黄芩苷对照品溶液,按“2.1.3”项方法紫外扫描,连续测定6次,RSD为0.057%,说明仪器的精密度良好。

2.1.6 稳定性实验 取同一供试品溶液,按“2.1.3”项方法操作,分别在放置0,20,40,60,80,100,120 min后测定其A值,RSD值为1.61%。表明供试品溶液在制备后120 min内基本稳定。

2.1.7 重复性实验 取同一批供试品(采收期为2013年10月1日)6份,按“2.1.2”项方法制备供试品溶液,按“2.1.3” 项方法测定A值。其RSD值为1.65%(n=6),表明重复性良好。

2.1.8 加样回收率实验 精密称取已知总黄酮含量的半枝莲粉末(采收期为2013年10月1日)9份,每份0.5 g,精密称定,分别精密加入一定量野黄芩苷对照品,按“2.1.2” 项方法制备供试品溶液,按“2.1.3” 项方法测定A值。计算回收率,结果表明测定方法稳定可靠。其结果见表1。

表1 总黄酮加样回收率实验
Tab.1 Result of recovery test of flavonoids n=9
原有量 加入量 测得量 回收率 平均回收率 RSD
mg %
21.75 16.12 38.32 102.79 102.03 0.95
21.75 16.12 38.25 102.36
21.75 16.12 38.02 100.93
21.75 20.03 41.82 100.20 100.20 1.55
21.75 20.03 41.51 98.65
21.75 20.03 42.14 101.80
21.75 24.04 46.23 101.83 101.72 0.87
21.75 24.04 45.98 100.79
21.75 24.04 46.40 102.54

表1 总黄酮加样回收率实验

Tab.1 Result of recovery test of flavonoids n=9

2.1.9 含量测定 取不同采收期的半枝莲供试品,按“2.1.2” 和“2.1.3”项方法操作,计算供试品中总黄酮含量,结果见表2。

表2 不同采收时间半枝莲中总黄酮、野黄芩苷及大波斯菊苷的含量
Tab.2 Result of content determination of flavonoids,scutellarin and cosmosiin in Scutellaria barbata D. Don of different harvest time mg·g-1,x¯±s,n=3
编号 采收时间 生长期 总黄酮含量 野黄芩苷含量 大波斯菊苷含量
1 2013-04-11 开花前期 42.49±0.66 3.76±0.11 10.82±0.11
2 2013-04-21 开花初期 55.00±0.85 3.80±0.01 15.67±0.33
3 2013-05-01 开花期 46.78±0.52 4.16±0.12 16.31±0.42
4 2013-05-11 开花期 44.99±0.92 4.64±0.12 14.92±0.35
5 2013-05-21 果实初期 38.00±0.33 4.40±0.06 13.21±0.25
6 2013-06-01 果实期 30.00±0.49 4.02±0.10 13.11±0.21
7 2013-06-11 果实成熟第1茬 26.00±0.46 3.24±0.01 22.37±0.30
8 2013-07-20 开花期 39.42±0.41 6.73±0.22 16.39±0.49
9 2013-08-11 果实成熟第2茬 35.11±1.23 5.02±0.30 12.46±0.23
10 2013-09-01 开花前期 45.00±0.47 6.44±0.15 20.60±0.32
11 2013-09-11 开花初期 46.50±1.23 6.69±0.02 19.69±0.42
12 2013-09-21 开花期 44.50±1.05 6.60±0.46 20.38±0.52
13 2013-10-01 开花期 43.50±1.65 6.45±0.17 22.35±0.43
14 2013-10-11 果实初期 31.00±0.49 3.66±0.10 10.82±0.20
15 2013-10-21 果实期 34.50±2.13 3.36±0.24 14.03±0.30
16 2013-11-01 果实成熟第3茬 32.00±0.55 3.25±0.02 6.53±0.07

表2 不同采收时间半枝莲中总黄酮、野黄芩苷及大波斯菊苷的含量

Tab.2 Result of content determination of flavonoids,scutellarin and cosmosiin in Scutellaria barbata D. Don of different harvest time mg·g-1,x¯±s,n=3

2.2 野黄芩苷和大波斯菊苷的含量测定

2.2.1 色谱条件 Agilent ODS色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以甲醇-冰醋酸-水(35:4:61)为流动相;检测波长为335 nm;流速1.0 mL·min-1;进样量10 μL;柱温:25 ℃[1]。在上述色谱条件下,分别取各对照品溶液和样品溶液各10 μL,注入液相色谱仪测定峰面积,计算样品中野黄芩苷及大波斯菊苷的含量。对照品溶液及供试品溶液的HPLC图见图1。


图1 3种溶液的 HPLC图 A.野黄芩苷对照品溶液; B.大波斯菊苷对照品溶液; C.样品溶液; 1.野黄芩苷; 2.大波斯菊苷

Fig.1 HPLC chromatogram of three kinds of solution A.scutellarin reference solution;B.cosmosiin reference solution;C.sample solution;1.scutellarin 2.cosmosiin

2.2.2 对照品溶液的制备 取野黄芩苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每毫升含152 μg的野黄芩苷对照品溶液。取大波斯菊苷对照品适量,精密称定,加甲醇每毫升含4 mg大波斯菊苷对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密吸取“2.1.2”项供试品溶液25 mL于蒸发皿中,水浴蒸干,用20%甲醇溶解定容至25 mL即得供试品溶液。

2.2.4 线性关系考察 取上述野黄芩苷对照品和大波斯菊苷对照品溶液,逐级稀释,配制成不同浓度的对照品溶液。精密吸取上述不同浓度的对照品溶液20 μL,进样分析,测定峰面积。以对照品进样浓度(X)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标,求得野黄芩苷回归方程Y=60.481X-170.87(r=0.999 6)。大波斯菊苷回归方程Y=26.110X-60.662(r=0.999 9)。结果表明,野黄芩苷和大波斯菊苷分别在7.6~98.8 μg·mL-1和12~400 μg·mL-1浓度范围呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度实验 分别取野黄芩苷对照品溶液(浓度0.098 8 mg·mL-1),大波斯菊苷对照品溶液(浓度0.2 mg·mL-1),连续进样6次,测定。结果野黄芩苷RSD为0.75%,大波斯菊苷RSD为1.77%。表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性实验 量取同一供试品溶液,分别于制备0,2,4,6,8,12,24 h后测定,结果野黄芩苷峰面积RSD=1.32%、大波斯菊苷峰面积RSD=1.08%。表明供试品溶液在制备后24 h内基本稳定。

2.2.7 重复性实验 取同一样品,平行制备6份供试品溶液,按上述色谱条件测定,计算含量,结果野黄芩苷RSD=0.17%、大波斯菊苷RSD=0.43%。表明方法的重复性良好。

2.2.8 加样回收率测定 取已知含量的同一半枝莲粉末6份,每份约0.5 g,精密称定,分别精密加入一定量的野黄芩苷、大波斯菊苷对照品,按样品测定方法处理,测定,计算得野黄芩苷平均回收率96.36%,RSD=0.83%;大波斯菊苷平均回收率96.35%,RSD=0.75%,表明测定方法稳定可靠,见表3,4。

表3 野黄芩苷加样回收率实验
Tab.3 Result of recovery test of scutellarin n=6
原有量 加入量 测得量 回收率/
%
mg
3.01 2.41 5.31 95.44
3.01 2.41 5.35 97.10
3.01 2.89 5.78 95.85
3.01 2.81 5.75 97.51
3.01 3.62 6.50 96.41
3.01 3.62 6.48 95.86

表3 野黄芩苷加样回收率实验

Tab.3 Result of recovery test of scutellarin n=6

表4 大波斯菊苷加样回收率实验
Tab.4 Result of recovery test of cosmosiin n=6
原有量 加入量 测得量 回收率/
%
mg
11.16 8.60 19.51 97.09
11.16 8.46 19.27 95.86
11.16 11.16 21.87 95.97
11.16 10.85 21.72 97.33
11.16 12.98 23.67 96.38
11.16 12.87 23.45 95.49

表4 大波斯菊苷加样回收率实验

Tab.4 Result of recovery test of cosmosiin n=6

2.2.9 不同的采收时间半枝莲野黄芩苷及大波斯菊苷的含量 采用上述色谱条件,对半枝莲样品进行测定,按外标法以峰面积计算野黄芩苷和大波斯菊苷的含量。结果见表2。野黄芩苷和大波斯菊苷的平均含量分别为(5.58±0.16),(17.39±0.42) mg·g-1。

3 讨论

从以上16批不同采收期半枝莲药材中总黄酮含量的动态变化进行分析,发现不同采收期的半枝莲中总黄酮和野黄芩苷的含量均明显超过了《中华人民共和国药典》(2010年版)的规定标准(总黄酮不少于1.5%,野黄芩苷不少于0.2%)。从整个采收期来看,半枝莲药材在开花期的总黄酮和野黄芩苷的含量最高,除第2茬总黄酮含量稍低,其采割次数对半枝莲中黄酮含量影响不大。通过分析比较发现,半枝莲中总黄酮和野黄芩苷的含量大小总体依次为开花期>开花前期>果实期>果实成熟期,故半枝莲采收期为枝繁叶茂的开花期。

半枝莲在11月采收后,在霜降之前还可采收1茬,但长势矮小,茎枝细小,霜降后倒苗。这样在南方的半枝莲一年可收4茬。但实际生产中由于5月和10月左右雨水充足,半枝莲长得较粗壮,高40~60 cm,亩产量较高。而7-8月和11月以后由于干旱,半枝莲细小,高10~20 cm,亩产量低,而且花期和果实期非常短。从经济效益上建议收割第1和第3茬销售,第2和第4茬可做采种期。其中第1和第3茬总黄酮含量相当,但第3茬野黄芩苷含量高于第1茬,可能由于叶中野黄芩苷含量较高原因[9],第1茬茎粗壮,叶较少。而第3茬的半枝莲茎略细小,叶较为丰富。

此外,笔者还对半枝莲样品进行了水分、灰分、浸出物等常规测定,结果均符合《中华人民共和国药典》(2010年版)规定标准,说明仿野生抚育基地生产的药材是优质的,适宜大规模开展半枝莲药材的栽培。

The authors have declared that no competing interests exist.
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分光光度法,紫外-可见
色谱法,高效液相
采收期
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Flavonoids
Spectrophotometry, ultrav...
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