目的 研究木犀草素与哌嗪共晶的制备与表征,体外溶解性以及大鼠体内药动学,并与二者同比例物理混合物进行对比。 方法 对共晶以及物理混合物进行粉末X射线衍射(PXRD)和差示扫描量热(DSC)分析,采用高效液相色谱法检测其体外溶解性,采用高效液相色谱-串联质谱技术测定大鼠灌胃给药的血药浓度,比较主要药动学参数的差异。 结果 共晶与木犀草素的PXRD、DSC等方法检测结果存在明显差异,在十二烷基硫酸钠溶液中的溶解度较物理混合物提高39%。大鼠灌胃给予共晶和物理混合物后,共晶的达峰时间和体内滞留时间明显缩短,药物浓度-时间曲线下面积增加。 结论 共晶改善了木犀草素溶解度和体内生物利用度,提高了木犀草素的成药性。
Objective To prepare,and characterize the cocrystal of luteolin and piperazine,and to compare the solubility and pharmacokinetics of luteolin cocrystal and mixture
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共晶是指2种或2种以上不同分子通过非共价相互作用力而处于同一晶格内的固体存在形式,既可以是药物-药物的组合,也可以是药物-化学小分子的组合,共晶技术是改善药物理化性质、提高成药性的有效手段[1]。药物形成共晶后化学结构不受影响,但理化性质得到改善[2,3]。药物共晶作为一种改善药物成药性的有效手段已引起广大药学研究者的关注[4,5,6]。药物共晶的性质与药学研究不断有新颖和深入的发现,熊果酸-乙醇共晶[7]以及加入十二烷基硫酸钠灌胃给药后熊果酸在大鼠体内的生物利用度显著提高。在抗菌药物共晶中[2],磺胺噻唑与苯巴比妥酸共晶可大大提高抗菌活性,使前者活性提高2倍以上。ARAUJO等[8]报道了氟苯咪唑的多个共晶,通过共晶改善了氟苯咪唑的溶解度,并因此提高了其体内血药浓度-时间曲线下面积(AUC)和吸收速率。因此,作为医药研究领域与药物晶体学工程研究的新兴交叉学科,药物共晶研究具有相当广阔的前景。
SPF级健康SD大鼠,雄性,体质量180~220 g,购自北京维通利华实验动物技术公司,实验动物生产许可证号:SCXK(京)2016-0006。 大鼠分笼饲养,自由饮食,饲养室温度(25±2) ℃,相对湿度(60±5)%,光暗周期同昼夜周期。
木犀草素由陕西惠科植物开发有限公司生产(批号:20121016,含量≥96.0%);哌嗪由北京偶联科技有限公司生产(批号:20170226,含量≥95.0%);木犀草素与哌嗪共晶及同比例混合物均由中国医学科学院药物研究所药物晶型研究中心晶型药物研究北京市重点实验室自制。
Rigaku Smartlab 粉末X 射线衍射仪(日本Rigaku 公司);Mettler Toledo DSC 差示扫描量热仪(瑞士Mettler Toledo 公司);Five Easy 型pH 计(瑞士Mettler Toledo 公司);Agilent 1200 型高效液相色谱仪(美国Agilent 公司);XS 105 Dual Range 型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司,感量:0.01 mg);Agilent 1200系列液相质谱联用色谱仪(G1379B在线脱气机,G1311A四元梯度泵,G1329A 自动进样器,G1315DDAD检测器及系统控制器,G1316A柱温箱,6110单四级杆质谱仪,ESI离子源,Agilent公司,美国);Allegra TMX-22R全自动高速冷冻离心机(Beckman公司,美国);Vortex-Genie 2 漩涡混匀器(上海凡劲仪器设备有限公司);Organomation N-EVAP 系列氮吹仪(Organomation公司,美国);固体灌胃器(中国医学科学院药物研究所国家药物筛选中心研制);Eppendorf 移液器(Eppendorf 公司,德国)等。
CuKα 辐射,石墨单色器,管压40 kV,管流150 mA,2θ 扫描范围3°~40°,扫描速度8°·min-1,步长0.02°,发散狭缝DS=1°,接收狭缝为RS=0.15 mm,防散射狭缝为SS=1°。
样品量3~10 mg,精密称定。以空铝坩埚作为参比,氮气(N2)气氛 50 mL·min-1,扫描温度范围:30~350 ℃,升温速率:10 ℃·min-1。
共晶制备方法:精密称取木犀草素286.2 mg,哌嗪172.3 mg(摩尔比1:2)混合均匀,加入乙酸乙酯0.5 mL,轻轻研磨直至溶剂挥干,即得。物理混合物制备方法:按摩尔比1:2精密称取木犀草素和哌嗪,混合均匀,即得。
色谱柱Agilent SB-C18,柱温30 ℃。流动相,梯度洗脱:0~10 min,乙腈:0.1%甲酸=25:75(
取雄性SD大鼠,随机分组,每组3只,动物自由饮水,禁食12 h后,根据设计于上午9:00按相同剂量固体灌胃给予木犀草素哌嗪共晶以及同比例物理混合物。给药5,15,30,45 min,1,1.5,2,3,6,9,12 h,眼龇内静脉丛取血约0.4 mL,至肝素化抗凝管,4 ℃、5000 r·min-1 离心10 min(
实验结果中计量资料以均数±标准差($\bar{x}±s$) 表示,以
2.1.1 PXRD分析 PXRD分析法可用于不同晶型物质鉴别,是木犀草素与哌嗪共晶的的有效分析方法,共晶和单一哌嗪、木犀草素的PXRD图谱在衍射峰数量、衍射峰位置、衍射峰强度、衍射峰拓扑图形等方面均存在明显差异,表明木犀草素与哌嗪共晶和单一哌嗪与木犀草素既不相同也不等同,证明了共晶形成,图谱见
图1
哌嗪、木犀草素及两者共晶的PXRD图谱
A.哌嗪;B.木犀草素;C.木犀草素与哌嗪共晶。
Fig.1
PXRD patterns of piperazine,luteolin and their cocrystal
A.piperazine;B.luteolin;C.luteolin and piperazine cocrystal.
2.1.2 DSC分析 DSC法是一种热分析法。该方法测量的是在程序控制温度下,测量输入到试样和参比物的功率差与温度的关系。由
图2
哌嗪、木犀草素及两者共晶的DSC图谱
A.哌嗪;B.木犀草素;C.木犀草素与哌嗪共晶。
Fig.2
DSC curves of piperazine,luteolin and their cocrystal
A.piperazine;B.luteolin;C.luteolin and piperazine cocrystal.
2.1.3 红外光谱分析 采用红外光谱法对木犀草素、哌嗪及共晶进行表征,其红外吸收光谱如
为了验证晶型状态与晶型溶解性质的关系,对木犀草素、哌嗪及共晶进行溶解性质评价。参照溶解度测定方法[16]测定。采用高效液相色谱法,利用样品的色谱峰面积数据对样品溶解的浓度进行计算,以时间为横坐标,溶剂浓度为纵坐标分别绘制溶解度曲线,溶解性数据见
按照“1.7”项下色谱条件进行实验,木犀草素的保留时间为7.0 min,在空白血浆相应位置处无吸收峰,说明该方法具有专属性。结果见
2.4.1 血药浓度-时间曲线 共晶和物理混合物口服后在大鼠体内的血药浓度-时间曲线见
图6
共晶及物理混合物血药浓度-时间曲线($\bar{x}±s$,
Fig.6
Mean plasma concentration-time curves of cocrystal and physical mixture($\bar{x}±s$,
2.4.2 共晶及物理混合物在大鼠体内的药动学参数 木犀草素与哌嗪共晶以及同比例物理混合物的药代参数如
药物共晶是在不改变其化学结构的前提下,理化性质得到改善的一种强有力的方法。木犀草素具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等良好的药理活性,但是成药性差,最重要的原因之一就是溶解度等理化性质差、生物利用度差,最终影响在体吸收过程,这是影响药理活性的关键,药物在体吸收浓度直接影响药物的有效性和安全性,因此,寻找提高生物利用度的方法尤其重要。近年来,对于溶解性的改善方面的研究很多,主要是将药物做成包合物[17],结构修饰做成前药[18]。本文通过共晶的方式明显改善了木犀草素的溶解性差的问题。
木犀草素多个羟基基团为其形成共晶创造了良好的条件,本研究采用化学小分子哌嗪进行共晶结合,制备后通过不同方法进行表征,发现PXRD、红外光谱分析与DSC均能有效鉴别共晶与物理混合物。通过溶解性实验观察到在0.5%十二烷基硫酸钠溶剂系统中,共晶溶解度较物理混合物有重要提高,这对生物利用度的提高有重要意义。
同时,大鼠初步体内药动学研究结果显示,与物理混合物相比,共晶固体口服给药在大鼠体内的峰浓度大于物理混合物,且达峰时间明显缩短,证明共晶能迅速发挥治疗作用,具有更好的临床应用前景。
药物共晶研究对于新药的开发以及现有药物的优化都十分重要。木犀草素是一种黄酮类化合物,哌嗪是一种化学小分子,一种生物活性较强的物质与一种并无明确药效作用的物质结合,其药理作用是否会进一步发生改变,还有待深入研究发掘。