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美国《化学文摘》《国际药学文摘》
《乌利希期刊指南》
WHO《西太平洋地区医学索引》来源期刊
日本科学技术振兴机构数据库（JST）
第七届湖北十大名刊提名奖
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第七届湖北十大名刊提名奖
, 丁曼
, DING Man
目的 建立比那甫西颗粒指纹图谱,制定同时测定制剂中没食子酸、秦皮乙素和甘草酸铵含量的方法。
方法 采用高效液相色谱法(HPLC)建立12批比那甫西颗粒的指纹图谱并进行峰归属,色谱柱为安捷伦TC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),以乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相梯度洗脱,检测波长为272 nm。采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012版)对12批比那甫西颗粒的指纹图谱进行相似度分析,结合聚类分析、主成分分析对比那甫西颗粒进行质量评价;采用HPLC法测定制剂中没食子酸、秦皮乙素和甘草酸铵的含量。
结果 12批比那甫西颗粒的HPLC特征图谱,标定共有峰21个,归属5个峰,相似度均>0.9,聚类分析将样品分为3类,主成分分析筛选出3个特异性标志物;3个成分的浓度分别在0.024 7~0.617 5、0.037 5~0.937 5、0.058 0~1.450 0 mg·mL-1范围内与峰面积线性关系良好,平均回收率(
Objective The HPLC fingerprint chromatogram was established,and an HPLC method was established for the content determination of gallic acid,aesculetin,and ammonium glycyrrhizinate in binafuxi granules.
Methods HPLC determined the fingerprint chromatogram of 12 batches of binafuxi granules,and the peak attribution was carried out.The Agilent TC-C18 column(250 mm×4.6 mm,5 μm) was used with the mobile phase of acetonitrile-0.05% phosphoric acid solution for gradient elution.The detection wavelength was 272 nm.Chinese medicine chromatographic fingerprint similarity evaluation software (2012 edition) was used to analyze the similarity of fingerprint of 12 batches of benafoxi granules,combined with cluster analysis and principal component analysis to compare the quality of benafoxi granules.The contents of gallic acid,aesculetin,and ammonium glycyrrhizinate in the preparation were determined by HPLC.
Results Twenty-one common peaks were identified using HPLC characteristics of fingerprints of 12 batches of binafuxi granules,and five were identified.The similarity was higher than 0.9.Cluster analysis divided the samples into three categories,and principal component analysis screened three specific markers.The concentration line ranges of three components were 0.024 7—0.617 5,0.037 5—0.937 5,and 0.058 0—1.450 0 mg·mL-1.The average recovery rates were 97.24%—103.02%,with RSD of 0.64%—1.12% (
开放科学(资源服务)标识码(OSID)
比那甫西颗粒,由天山堇菜、玫瑰花、盒果藤、甘草浸膏、司卡摩尼亚脂、阿里红六味药组成。处方是根据现代中医药理论及维吾尔医理论组成的复方制剂,在和田地区和喀什地区的医院临床使用已有20多年,具有清除体内异常体液质、清脑、止头痛、化痰止咳的功效,多用于治疗热性感冒[1]。比那甫西颗粒针对热性(干热、湿热)感冒1487例疗效观察,总有效率为85%。近年的临床结果统计,比那甫西颗粒70%用于热性感冒,30%用于其他适应证引起的发热、咳嗽等病症,具有显著良好的临床效果,并已取得医疗机构院内制剂的批准文号。
目前,比那甫西颗粒质量标准仅有薄层鉴别项,无含量测定项,不够全面科学,不同批次制剂的质量难以准确评价,质量不稳定和不均一,缺乏有效的质量控制手段。因此,本研究对制剂进一步深入研究,首次以处方中主要药材特征性成分为基础,建立比那甫西颗粒的对照指纹图谱;以制剂中君药天山堇菜和玫瑰花的主要成分和处方比例较高甘草浸膏的主要成分为指标,建立了秦皮乙素、没食子酸和甘草酸铵的含量测定方法,提升了制剂的质量标准,为该品种生产过程及质量控制提供依据。
1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);CPA-225D电子天平(Sartorius公司,感量:0.01 mg);安捷伦TC C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);AS-10250BDT型超声清洗仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。
比那甫西颗粒,编号S1~S12,批号分别为:Y170521、Y170641、20190308、20190315、20190307-1、20190307-2、20190316、Y190501、Y190502、Y170638、Y170642、Y180921,新疆银朵兰药业股份有限公司。没食子酸(批号:110831-201605,含量90.8%)、秦皮乙素(批号:110741-201708,含量99.9%)、甘草酸铵(批号:110731-201619,含量93%)以上对照品,均购于中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯,水为超纯水,其余试剂均为分析纯。
2.1.1 混合对照品溶液的制备 精密称取没食子酸、秦皮乙素、甘草酸铵对照品适量,加50%甲醇溶液制成每毫升分别含2.47,3.75,5.80 mg的混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液1.0 mL,置10 mL量瓶中,加50%甲醇溶液至刻度,摇匀,即得混合对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液的制备 精密称定本品1.0 g,置烧瓶中,加50%甲醇溶液20 mL,称定质量,加热回流提取45 min,放冷,用50%甲醇溶液补重,摇匀,取上清液滤过,取续滤液,即得。
2.1.3 阴性样品溶液的制备 按比那甫西颗粒处方工艺,分别制备不含天山堇菜、玫瑰花和甘草浸膏的阴性样品,按“2.1.2”项下方法制备阴性样品溶液。
Agilent TC-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);以乙腈为流动相A,以0.05%磷酸溶液为B,按
表1 流动相梯度洗脱程序
Tab.1 Mobile phase gradient elution procedure
2.3.1 精密度试验 取“2.1.1”项的混合对照品溶液,依“2.2”项测定,以甘草酸铵峰为参照峰,计算各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD。结果相对保留时间RSD<1.0%,相对峰面积RSD<4.5%。表明该仪器精密度良好。
2.3.2 稳定性试验 取比那甫西颗粒(批号:Y170521)1.0 g,依“2.1.2”项处理,在10 ℃下放置 0,2,4,8,12,24 h时,依“2.2”项测定,以甘草酸铵峰为参照峰,计算各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD。结果相对保留时间RSD<1.0%,相对峰面积RSD<4.5%。表明供试品溶液在10 ℃放置24 h内稳定。
2.3.3 重复性试验 取比那甫西颗粒(批号Y170521)6份,各1.0 g,按“2.1.2”项处理,依 “2.2”项测定,记录峰面积,以甘草酸铵峰为参照峰,计算各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD。结果相对保留时间RSD<1.0%,相对峰面积RSD<5.0%。表明该方法重复性良好。
2.4.1 特征图谱的建立及共有峰的标定 取12批比那甫西颗粒样品(S1~S12),依“2.1.2”项处理,依“2.2”项测定,记录色谱图,采用“中药色谱指纹图谱相似度评价(2012版)” 软件进行色谱峰匹配,样品S1的色谱图设为参照图谱,经多点校正和峰匹配,生成对照图谱,共标定21个共有峰。结果见
图1
12批比那甫西颗粒的指纹图谱
S1~S12.12批比那甫西颗粒;R.对照。
Fig.1
Fingerprints of 12 batches of binafuxi granules
S1-S12.twelve batches of binafuxi granules;R.Reference.
2.4.2 色谱峰归属分析 分别取S1样品、玫瑰花药材、天山堇菜药材、甘草浸膏、缺玫瑰花阴性样品、缺天山堇菜阴性样品和缺甘草浸膏阴性样品,依“2.1.2”项制备供试品溶液,依“2.2”项色谱条件测定,记录色谱图,结果见
图2
供试品、药材与阴性样品色谱图
A.供试品;B.天山堇菜药材;C.玫瑰花药材;D.甘草浸膏药材;E.不含天山堇菜阴性样品;F.不含玫瑰花阴性样品;G.不含甘草浸膏阴性样品。
Fig.2
HPLC chromatograms of sample,herband negative samples
A.sample;B.viola tianshanica maxim;C.rose;D.licorice extract;E.negative sample without viola tianshanica maxim;F.negative sample without rose;G.negative sample without licorice extract.
2.4.3 相似度评价 将12批样品的HPLC指纹图谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行相似度评价。结果12批样品与对照指纹图谱的相似度均大于0.9,具有相似性,表明比那甫西颗粒的生产工艺稳定。
2.4.4 聚类分析 采用SPSS21.0版统计学软件对12批次比那甫西颗粒指纹图谱的21个共有峰相对峰面积进行聚类分析,采用组间联结法,度量标准为欧式平方距离,结果见
2.4.5 主成分分析 将12批样品的21个共有峰相对峰面积导入SIMICA-P11.5版软件进行主成分分析,前3个成分的累计方差贡献率为81.005%,表明前3个主成分能够包含比那甫西颗粒色谱的主要信息。主成分分析得分图见
表2 主成分分析结果
Tab.2 Principal component analysis results
2.5.1 色谱条件 色谱柱Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);以乙腈为流动相A,以0.05%磷酸溶液为流动相B,按
表3 流动相梯度洗脱程序
Tab.3 Mobile phase gradient elution procedure
2.5.2 系统适用性试验 分别吸取“2.1”项下的混合对照品、供试品溶液和阴性样品溶液,依“2.5.1”项测定,供试品中3个成分的主峰与相邻峰均能达到基线分离,分离度>1.5;供试品溶液色谱图中,在与3个成分对照品色谱峰相应的位置上,有相同保留时间的色谱峰,阴性无干扰。见
图5
5种溶液的HPLC色谱图
1.混合对照品溶液;B.供试品溶液;C.不含山堇菜阴性对照溶液;D.不含玫瑰花阴性对照溶液;E.不含甘草浸膏阴性对照溶液;1.没食子酸;2.秦皮乙素;3.甘草酸铵。
Fig.5
HPLC chromatograms of five solution
A.mixed reference;B.sample;C.negative sample without viola tianshanica maxim;D.negative sample without rose;E.negative sample without licorice extract;1.gallic acid;2.aesculetin;3.ammonium glycyrrhizinate.
2.5.3 提取方法及提取时间考察 本实验对供试品的提取方法及提取时间进行了筛选,结果加热回流提取45 min时,3个指标的提取效率最高,故选择加热回流提取45 min为供试品提取方法,见
表4 提取方法及时间的考察结果
Tab.4 Investigation results of extraction method and time
2.5.4 提取溶剂的考察 本实验对供试品的提取溶剂进行了筛选,结果提取溶剂为50%甲醇时,3个指标的提取效率相对较高,故选择50%甲醇溶液为供试品提取溶液,结果见
表5 提取溶剂的考察结果
Tab.5 Investigation results of extraction solvent
2.5.5 线性关系考察 分别精密量取“2.1.1”项混合对照品储备溶液0.1,0.25,0.5,1.0,2.0,2.5 mL,置10 mL量瓶中,加50%甲醇定容至刻度,摇匀,依“2.5.1”项测定。以对照品的进样量(
表6 3个成分线性方程
Tab.6 Linear equations of three components
2.5.6 耐用性考察 本实验对不同厂家色谱柱(Agilent、Thermo、Cosmosil)、不同柱温(25,30,35 ℃),不同流速(0.8,1.0,1.2 mL·min-1)进行了考察,结果不同变动因素对含量测定结果的影响较小,均满足系统适用性要求,见
表7 3种成分耐用性考察结果
Tab.7 Durability test results of three components
2.5.7 精密度实验 取“2.1.1”项下混合对照品溶液适量,依“2.5.1”项测定,记录峰面积。结果1~3的峰面积RSD分别为0.59%,0.10%,0.89%,表明实验所用仪器精密度良好。
2.5.8 稳定性实验 取同一批次供试品溶液(批号:Y180921),10 ℃下分别于0,2,4,8,12,24 h时,依 “2.5.1”项测定,记录峰面积。结果1~3的峰面积RSD分别为0.42%,0.43%,1.55%,表明供试品溶液在10 ℃放置24 h内稳定性良好。
2.5.9 重复性实验 取同一批次供试品(批号:Y180921),按“2.1.2”项方法处理6份,依“2.5.1”项测定,计算1~3的含量。结果1~3含量的RSD分别为1.01%,0.73%,0.39%,表明该方法重复性良好。
2.5.10 日间精密度实验 取同一批次供试品(批号:Y180921),不同人员在不同日期,按“2.1.2”项处理,按“2.5.1”项测定,计算1~3的含量。结果1~3含量的RSD分别为1.45%、1.56%、0.86%。表明该方法日间精密度良好。
2.5.11 加样回收率实验 取已知含量的样品(批号:Y180921)约0.5 g,共6份,分别加入一定质量浓度的没食子酸、秦皮乙素、甘草酸铵对照品溶液适量,按“2.1.2”项方法处理,依“2.5.1”项测定,计算1~3的平均回收率,分别为102.18%,99.22%,102.04%,RSD分别为0.64%,1.12%,0.80%。
2.6 12批样品含量测定
取12批比那甫西颗粒适量,按“2.1.2”项方法处理,依“2.5.1”项测定,计算含量,结果见
表8 样品含量测定结果
Tab.8 Content determination results of samples mg·g-1
本实验对3个成分的对照品溶液和供试品溶液在波长200~400 nm内进行全波长扫描,结果波长为272 nm处供试品色谱峰数最多、基线分离最好,故选择272 nm为指纹图谱研究检测波长;没食子酸最大吸收波长272 nm,秦皮乙素最大吸收波长344 nm,甘草酸铵最大吸收波长250 nm,因此含量测定方法的检测波长确定为250,272,344 nm。参考《中华人民共和国药典》中秦皮乙素、没食子酸及甘草酸铵的含量测定方法,考虑操作简便、省时、节约、环保等因素,故选择3个指标同时测定。采用甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相时秦皮乙素和没食子酸的峰较宽,乙腈为流动相时3个指标的色谱峰均对称性好、峰形优,故采用乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相。
本实验建立了比那甫西颗粒的指纹图谱,确定21个共有峰,鉴定了5个成分。相似度评价结果表明,不同批次的样品相似度均>0.9,相似性较好,差异较小,表明该制剂具有良好的稳定性。
通过对12批制剂进行聚类分析和主成分分析,发现不同年份生产的制剂各为一类,并筛选出3个主成分,提示在药物生产过程中需要重点关注该3种成分的变化。
处方中天山堇菜和玫瑰花为君药,而这两种药材现有的质量标准中均无含量测定项,且相关文献较少。笔者通过标准物质比对及实验积累经验确定了该制剂的含量测定指标为秦皮乙素、没食子酸,控制制剂中天山堇菜和玫瑰花的质量;甘草浸膏占处方比例较大,因此选择甘草酸铵为含量测定指标,控制制剂中甘草浸膏的质量。
比那甫西颗粒12批含量测定结果研究发现,秦皮乙素含量存在较大差别。笔者进一步测定了制剂中所用的天山堇菜药材,发现药材中秦皮乙素的含量差异较大,造成了制剂含量的差异性,可能与采摘时间、地点、自然环境、存储等条件有关。因此,在生产制剂中应重点关注该药材的质量,保证产品质量的稳定性和一致性。
本研究建立的比那甫西颗粒HPLC特征指纹图谱分析方法能够全面系统地反映比那甫西颗粒的质量,并建立了同时测定没食子酸、秦皮乙素和甘草酸的方法,有效评价出不同批次的制剂质量及需要关注的质量标志成分,提升了该制剂的质量标准,为比那甫西颗粒生产过程的监控提供了理论依据,并为临床安全有效的应用提供了实验依据。
