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美国《化学文摘》《国际药学文摘》
《乌利希期刊指南》
WHO《西太平洋地区医学索引》来源期刊
日本科学技术振兴机构数据库（JST）
第七届湖北十大名刊提名奖
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第七届湖北十大名刊提名奖
, 李珉, 李玉立, 李潇, 李文东
, LI Min, LI Yuli, LI Xiao, LI Wendong,
目的 建立检测甲型肝炎灭活疫苗和23价肺炎球菌多糖疫苗原液中去氧胆酸钠残留量的高效液相色谱-电雾式检测器方法。
方法 采用安捷伦SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为1%甲酸溶液-1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脱,柱温30 ℃,流速1.0 mL·min-1,进样量50 μL,电雾式检测器雾化器温度60 ℃,数据采集频率10 Hz,过滤常数3.6 s。
结果 样品中其他组分与去氧胆酸钠分离良好,对测定无干扰。去氧胆酸钠在0.475~47.50 μg·mL-1浓度范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系(
Objective To develop and verify a method for determining residual sodium deoxycholate in the bulk of inactivated hepatitis A vaccine and 23-valent pneumococcal vaccine by high performance liquid chromatography (HPLC) coupled with charge aerosol detection (CAD).
Methods An Agilent SB-C18 column (4.6 mm×250 mm,5 μm) with a column temperature of 30 ℃ was adopted.The mobile phase was composed of water containing 1% formic acid and acetonitrile containing 1% formic acid,while the gradient eluted at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The injection volume was 50 μL.The evaporating temperature of CAD was 60 ℃,while the collection rate was 10 Hz,and the filter constant was 3.6 s.
Results Any other peaks were separated entirely from the peak of sodium deoxycholate and showed no interference with the determination result.The linear range of sodium deoxycholate was 0.475-47.50 μg·mL-1,with correlation coefficients (
开放科学(资源服务)标识码(OSID)
去氧胆酸钠(sodium deoxycholate)是一种胆盐,具有使细胞膜稳定性下降、流动性增强、膜结构有序性降低的作用[1]。在生物医药领域,如甲型肝炎灭活疫苗、23价肺炎球菌多糖疫苗在原液生产收获阶段,均以去氧胆酸钠为裂解剂,以裂解宿主细胞或细菌菌体,从而收获病毒或多糖。正是由于其所具有的上述生理功能,一定量去氧胆酸钠对胃黏膜细胞、鼻黏膜细胞以及胰腺腺泡细胞均有损伤作用[2,3,4]。因此,若疫苗制品中存在去氧胆酸钠残留,当其注入人体后,亦存在造成人体细胞损伤的潜在风险。甲型肝炎灭活疫苗的主要接种对象为儿童,而23价肺炎球菌多糖疫苗的主要接种对象为儿童和老人,因年幼或年老人群对毒性物质的耐受能力均较弱,因此更有必要对这两种疫苗中去氧胆酸钠的残留量进行严格控制。
《中华人民共和国药典》2020年版收载的疫苗原液去氧胆酸钠残留量测定方法是依据去氧胆酸钠在酸性条件下生成有色化合物,用紫外分光光度法测定[5]。笔者在实际检验过程中发现,该方法存在灵敏度不高的问题,标准曲线最高浓度点(80 μg·mL-1)紫外吸光值尚不足0.1,而最低浓度点(10 μg·mL-1)紫外吸光值仅约0.02,不符合《中华人民共和国药典》2020年版通则0401紫外-可见分光光度法关于“吸光度读数以在0.3~0.7之间为宜”的要求[6],且测定过程大量用到43.5%硫酸溶液,需使用浓硫酸进行配制,并需70 ℃高温加热,存在安全隐患。最新研究报道了采用液质联用仪测定多糖疫苗中去氧胆酸钠残留量的方法[7]。但由于液质联用仪对操作者的专业水平及仪器日常维护保养均存在较高要求,故在现阶段作为疫苗生产厂家的日常质控手段尚存在一定难度。高效液相色谱(HPLC)法是现代分析化学中最常用的一种色谱方法。但由于胆酸类物质缺少共轭结构,仅在末端吸收波长处有紫外吸收,因而采用紫外检测器建立的测定方法其灵敏度并不理想[8]。近年来,电雾式检测器(charged aerosol detection,CAD)作为一种不依赖被测物化学结构的通用型检测器,因通用性强、灵敏度高、重复性好,已逐渐成为检测弱紫外吸收物质的优选方法[9,10]。笔者在本实验建立采用高效液相色谱-电雾式检测器测定甲型肝炎(甲肝)灭活疫苗和23价肺炎球菌多糖疫苗原液去氧胆酸钠残留量的方法,对该方法进行验证,并与另一种常见通用型检测器——蒸发光散射检测器(evaporative light scattering detector,ELSD)进行比较,旨在为提升相关质量标准提供参考。
Thermo Ultimate3000型高效液相色谱仪,配备Corona Veo RS电雾式检测器(美国ThermoFisher公司);岛津20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司),配备2000ES型ELSD检测器(美国Alltech公司);METTLER XA205型十万分之一电子天平(瑞士梅特勒公司,感量:0.01 mg);Milli-Q型超纯水机(美国Millipore公司);Agilent SB-C18色谱柱(美国安捷伦公司),配备ZORBAX SB-C18保护柱(美国安捷伦公司)。
去氧胆酸钠(美国Sigma公司,批号:SLCG9031,含量:100%);甲酸(液相色谱/质谱纯,美国ThermoFisher公司,批号:212271);乙腈(色谱纯,美国Sigma公司,批号:WXBC8825V)。甲肝灭活疫苗原液(国内某生物制品企业生产,批号:01-E2011-025、01-E2011-026、01-E2011-027),23价肺炎球菌多糖疫苗原液(国内某生物制品企业生产,批号:7F-2020001、12F-2019001、7F-2019001)。
色谱柱:Agilent SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流动相:1%甲酸溶液(A)-1%甲酸乙腈溶液(B)梯度洗脱。洗脱程序:0 min,25% B;0~4 min,25%→60% B;4~16 min,60% B;16~22 min,60%→25% B。柱温30 ℃,流速1.0 mL·min-1,进样量50 μL。CAD雾化器温度60 ℃,数据采集频率10 Hz,过滤常数3.6 s,幂律函数值(power function value,PFV) 1.0。
2.2.1 对照品贮备液的制备 精密称取105 ℃干燥至恒质量的去氧胆酸钠95.00 mg,置100 mL量瓶,加甲醇溶解并稀释至刻度,作为对照品贮备液。
2.2.2 供试品溶液的制备 取各批次疫苗原液作为供试品溶液。
取空白溶液(磷酸盐缓冲液,PBS,与疫苗原液配制所用基质一致)、4.750 μg·mL-1对照品溶液(取“2.2.1”项对照品贮备液适量,加水稀释成去氧胆酸钠浓度为4.750 μg·mL-1溶液)、疫苗原液以及添加去氧胆酸钠对照品的疫苗原液(取“2.2.1”项对照品贮备液5 μL,两份,各置1 mL量瓶,分别加甲肝、肺炎疫苗原液稀释并定容,甲肝疫苗原液加入对照品浓度为3.80 μg·mL-1、肺炎疫苗原液加入对照品浓度为4.75 μg·mL-1)分别进样,记录色谱图。结果显示,去氧胆酸钠峰与供试品溶液中其他杂峰(如蛋白质、多糖及磷酸盐缓冲液中物质)基线分离(分离度>2.0),空白溶液在去氧胆酸钠出峰位置无色谱峰,专属性良好。色谱图见
图1
系统适用性实验色谱图
A.空白溶液;B.对照品溶液;C.甲肝疫苗原液;D.肺炎疫苗原液;E.加入对照品的甲肝疫苗原液;F.加入对照品的肺炎疫苗原液。
Fig.1
HPLC chromatograms of system suitability test
A.blank solution;B.standard solution;C.bulk of hepatitis A vaccine;D.bulk of pneumococcal vaccine;E.bulk of hepatitis a vaccine spike with standard;F.bulk of pneumococcal vaccine spike with standard.
精密量取对照品贮备液适量,以水逐级稀释成去氧胆酸钠浓度为0.475,0.950,2.375,4.750,9.50,47.50 μg·mL-1线性测定溶液,按“2.1”项色谱条件分别进样,以浓度为横坐标(
取线性测定溶液中4.750 μg·mL-1浓度溶液,按“2.1”项色谱条件连续进样6次。结果显示,峰面积RSD为0.48%,表明该方法精密度良好。
称取去氧胆酸钠对照品约10 mg,平行称取2份,精密称定,各置10 mL量瓶,分别加甲肝、肺炎疫苗原液溶解并定容,作为加标母液。再分别精密量取两种加标母液5 μL,每种各取6份,分别置1 mL量瓶,加相应的同种疫苗原液定容,制成加入去氧胆酸钠浓度约为5 μg·mL-1的溶液,按“2.1”项色谱条件进样。结果显示,两种疫苗原液重复性实验峰面积RSD分别为0.33%和1.19%,表明该方法重复性良好。
取标准曲线浓度最低点溶液逐级稀释后进样,记录色谱图,根据去氧胆酸钠峰信噪比确定定量限和检出限。以检测信噪比(
称取去氧胆酸钠对照品10 mg,平行称取2份,精密称定,各置10 mL量瓶,分别加甲肝、肺炎疫苗原液溶解并定容,作为加标母液。再分别精密量取加标母液40,50,200 μL,置10 mL量瓶,加相应的同种疫苗原液定容,制成加入去氧胆酸钠浓度约为4,5,20 μg·mL-1疫苗原液,作为回收率测试溶液,每个疫苗品种、每个加标浓度的回收率测试溶液平行制备3份。按“2.1”项色谱条件项下进样,结果见
表1 CAD回收测定结果
Tab.1 Measurement results of CAD recovery
保持主要色谱条件不变,分别将流动相中甲酸含量以及将15 min时B相比例作细微调整,取回收率测试溶液中的添加去氧胆酸钠5 μg·mL-1的疫苗原液进样,考察去氧胆酸钠峰与其他杂峰分离度。结果当流动相的甲酸含量为1.0%(本实验拟定条件)、0.5%和1.5%时,分离度分别为14.7,13.4和16.1;而当流动相的B相比例为60%(本文拟定条件)、55%和65%时,分离度分别为14.7,21.2和10.2。即甲酸含量降低或B相比例提高时,去氧胆酸钠出峰时间前移,反之亦然,但与其前方的杂峰仍均可基线分离(分离度>2.0),表明方法耐用性良好。
分别取甲肝灭活疫苗原液及23价肺炎球菌多糖疫苗原液各3批,按建立的HPLC-CAD方法测定。结果显示,各批次原液中去氧胆酸钠含量均低于检出限,即<0.238 μg·mL-1,符合《中华人民共和国药典》2020年版规定不超过20 μg·mL-1的限度要求。
去氧胆酸钠作为一种极性物质,在普通C18色谱柱上保留较弱,因此在流动相中添加了甲酸以增强其保留,使之能够与样品中其他组分充分分离,并选用耐低pH值的色谱柱以保证其在酸性流动相中的峰型良好。因本实验采用的疫苗原液是直接进样,为避免其中蛋白质、多糖在大批量检验时对色谱柱造成损害,可在分析柱前连接一根保护性预柱。同时,由于蛋白、多糖及缓冲液中的组分均在7 min之前出峰,而去氧胆酸钠的出峰时间在约14 min,基于CAD检测器具有流路切换的功能,在完成方法学验证后的日常测定过程中,可将仪器流路自0~7 min切换至废液,7 min后再切换至检测器,避免疫苗原液中其他组分对检测器可能造成的污染。
笔者还尝试了HPLC-ELSD法对疫苗原液中去氧胆酸钠进行测定,即采用与CAD方法同样的色谱柱及流动相分离,ELSD设置条件为漂移管温度100 ℃,载气流量2.0 L·min-1。方法学验证结果显示,ELSD在0.950~47.50 μg·mL-1范围内,log-log拟合(ELSD不呈一次直线关系)相关系数0.998 7;仪器精密度RSD为6.40%;重复性RSD分别为5.79%(甲肝疫苗)、4.44%(肺炎疫苗);定量限和检出限分别为0.950和0.475 μg·mL-1,平均回收率分别为64.2%(甲肝疫苗)和58.1%(肺炎疫苗)。
上述验证结果表明,CAD在测定疫苗原液中去氧胆酸钠方面的精密度、重复性、准确度以及定量限、检出限等指标均优于ELSD。笔者认为其原因主要是CAD在液相色谱洗脱液由氮气分散雾化后,先将较大的雾滴排出至废液管,其余较小的雾滴再进入干燥管中受热干燥形成溶质颗粒进行检测;而ELSD则是雾化后的全部液相色谱洗脱液均进入漂移管加热干燥进入检测器。对于基质复杂、含有大量高分子物质的灭活病毒疫苗或细菌疫苗原液而言,ELSD的进样模式更易造成对检测器内部的污染,从而对结果产生影响。因而对于含有较多蛋白类物质的样品而言,若采用ELSD测定其中小分子物质残留,则往往需要先对样品进行超滤等纯化步骤后方可准确测定[11]。
迄今为止,接种疫苗仍然是人类预防传染病最有效、最经济的措施之一[12]。因此,疫苗产品的安全性也一直是全社会关注的热点。本实验中2种疫苗原液各3批样品的测定结果表明,原液生产过程中添加的去氧胆酸钠在其后的纯化提取等过程可较为有效地去除。且由于后续半成品及成品生产过程不再涉及去氧胆酸钠的引入,因此只要相关企业严格按照工艺要求进行生产,成品中去氧胆酸钠残留量的安全性是有保障的。
