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美国《化学文摘》《国际药学文摘》
《乌利希期刊指南》
WHO《西太平洋地区医学索引》来源期刊
日本科学技术振兴机构数据库（JST）
第七届湖北十大名刊提名奖
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, 费瀚雨, FEI Hanyu
目的 建立高效液相色谱法测定曲伏噻吗滴眼液中曲伏前列素有关物质的含量。
方法 采用Phenomenex LUNA 苯基己基色谱柱(3.0 mm×150 mm,3 μm)色谱柱;流动相A为20 mmol·L-1庚烷磺酸钠溶液(用磷酸调pH值至2.5),流动相B为甲醇,流动相C为乙腈,洗脱梯度;检测波长220 nm;柱温40 ℃;流速0.5 mL·min-1。
结果 在该色谱条件下,曲伏前列素与各杂质均可良好分离;曲伏前列素、曲伏前列素杂质A、曲伏前列素15-表非对映异构体、曲伏前列素5,6-反式杂质异构体、曲伏前列素15-酮衍生物分别在0.02~219.29 μg · mL-1(
Objective To establish a method for determining the related substances of travoprost in travoprost and timolol maleate eye drops by HPLC.
Methods The determination was performed on Phenomenex LUNA phenyl-hexyl column(3.0 mm×150 mm,3 μm)with gradient elution using 20 mmol·L-1 sodium heptane sulfonate solution(adjusted to pH 2.5 with phosphoric acid)as mobile phase A,methanol as mobile phase B and acetonitrile as mobile phase C,the detection wavelength was 220 nm;the temperature of the column was 40 ℃;the flow rate was 0.5 mL·min-1.
Results Under the optimized condition of HPLC chromatography,an excellent separation was achieved for travoprost and the impurities.The calibration curves for travoprost,travoprost related compound A,15-epi diastereomer,5,6-trans isomer and 15-keto derivative revealed good linearities over the range of 0.02-219.29 μg·mL-1(
开放科学(资源服务)标识码(OSID)
曲伏噻吗滴眼液(商品名:苏力坦)原研厂家为Alcon,其主药成分为每毫升溶液含曲伏前列素0.04 mg和马来酸噻吗洛尔5 mg(以噻吗洛尔计)。曲伏噻吗滴眼液在2020年版《中华人民共和国药典》、美国药典42版[United States Pharmacopoeia(42),USP42]、英国药典2021年版[British Pharmacopoeia(2021),BP2021]、欧洲药典第10版[European Pharmacopoeia(10.0),Ph.Eur10.0)及日本药局方第17版[Japan Pharmaceutical Administration (17),JPⅩⅦ]中均未收载,但在USP42[2]中收载有曲伏前列素原料及单方制剂滴眼液的质量标准。USP42中曲伏前列素滴眼剂的含量及有关物质均采用等度高效液相色谱(HPLC)法进行,但有关物质检查中杂质A与其他杂质在2个不同的色谱体系中进行。目前,国内外有关曲伏前列素质量控制方面的文献报道较少,笔者在本实验参照文献[2,3,4,5]优化色谱系统,建立曲伏噻吗滴眼液中曲伏前列素含量及其有关物质测定方法。
Waters e2695高效液相色谱仪(PDA紫外检测器、Empower色谱工作站),XS105DU电子天平(瑞士Mettler Toledo公司,感量:0.01 mg),超纯水机(美国Millipore公司,型号:Simlicity)。
曲伏前列素杂质A对照品(USP,批号:QOJ307,含量:31 μg ·mL-1),曲伏前列素15-表非对映异构体对照品(批号:120501,含量:99.4%)、曲伏前列素5,6-反式杂质异构体对照品(批号:120501,含量:99.7%)、曲伏前列素15-酮衍生物(批号:120501,含量:99.2%)、马来酸噻吗洛尔原料(批号:101204,含量:99.9%)、曲伏前列素对照品(批号:110301,含量:99.3%)、曲伏噻吗滴眼液(规格:2.5 mL,批号:111201,111202,111203,130401)均由武汉武药科技有限公司提供。甲醇和乙腈为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。
色谱柱为Phenomenex LUNA 苯基己基色谱柱(3.0 mm×150 mm,3 μm);流动相A为20 mmol·L-1庚烷磺酸钠溶液(用磷酸调pH值至2.5),流动相B为甲醇,流动相C为乙腈,洗脱梯度见
表1 流动相洗脱梯度
Tab.1 Elution gradient of mobile phase %
2.2.1 对照品溶液 精密称取曲伏前列素对照品约20 mg,置100 mL量瓶,用乙腈-水(30:70)溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品储备溶液;精密量取上述溶液5 mL,置25 mL量瓶,用水稀释至刻度,摇匀,即得对照品溶液。
2.2.2 杂质对照品储备溶液 精密称取曲伏前列素15-表非对映异构体、曲伏前列素5,6-反式杂质异构体和曲伏前列素15-酮衍生物对照品各约10 mg,分置250 mL量瓶,加乙腈-水(30:70)稀释至刻度,摇匀,即得各杂质对照品储备溶液。
2.2.3 供试品溶液 取本品,作为供试品溶液。
2.2.4 对照溶液 精密量取本品1 mL,置100 mL量瓶,用水稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液。
2.2.5 辅料溶液 除不含曲伏前列素外,其他组分均按处方量的5倍配制,即得。
2.2.6 供破坏溶液 取曲伏前列素对照品储备溶液5 mL,加辅料溶液5 mL,混匀,即得。
精密称取曲伏前列素杂质A、曲伏前列素15-表非对映异构体、曲伏前列素、曲伏前列素5,6-反式杂质异构体和曲伏前列素15-酮衍生物对照品各适量,加乙腈-水(30:70)定量稀释制成每毫升各约含4,4,400,16和4 μg的混合溶液;精密量取1 mL,加辅料溶液2 mL,用水稀释至10 mL,摇匀,作为系统适用性实验溶液。量取100 μL注入液相色谱仪,记录色谱图,见
图1
系统适用性色谱图
1.曲伏前列素杂质A;2.曲伏前列素15-表非对映异构体;3.曲伏前列素;4.曲伏前列素5,6-反式杂质异构体;5.曲伏前列素15-酮衍生物;6.辅料;7.苯扎氯铵。
Fig.1
HPLC chromatogram of system suitability test
1.travoprost impurity A;2.travoprost 15-epi diastereomer;3.travoprost;4.travoprost 5,6-trans impurity isomer;5.travoprost 15-keto derivative;6.pharmaceutical excipients;7.benzalkonium chloride.
取曲伏前列素对照品储备溶液5 mL、样品破坏溶液10 mL、辅料溶液5 mL,各6份,分置25 mL量瓶,进行不同条件下的降解实验,实验条件分别为:A.未经破坏;B.酸破坏:加3 mol ·L-1盐酸溶液2 mL,室温放置30 min后用3 mol ·L-1氢氧化钠溶液调pH至中性;C.碱破坏:加3 mol ·L-1氢氧化钠溶液2 mL,室温放置30 min,3 mol ·L-1盐酸溶液调pH至中性;D.热破坏:100 ℃水浴加热2 h;E.氧化破坏:加30%过氧化氢0.5 mL,室温放置10 h;F.光破坏:在365 nm波长紫外灯下光照24 h。上述6种条件下的样品均用水稀释至刻度,摇匀,按上述色谱条件,分别进样,记录色谱图(
图2
降解实验色谱图
Ⅰ.辅料溶液;Ⅱ.对照品溶液;Ⅲ.样品溶液;A.未破坏;B.酸破坏;C.碱破坏;D.热破坏;E.氧化破坏;F.光破坏;1.曲伏前列素杂质A;3.曲伏前列素;4.曲伏前列素5,6-反式杂质异构体;5.曲伏前列素15-酮衍生物;6.辅料;7.苯扎氯铵;8,9.未知杂质。
Fig.2
Chromatograms of degradation experiments
Ⅰ.pharmaceutical excipients solution;Ⅱ.standard solution;Ⅲ.sample solution;A.understroyed;B.destroyed by acid;C.destroyed by alkali;D.destroyed by heat;E.destroyed by oxidation;F.destroyed by light;1.travoprost impurity A;3.travoprost;4.travoprost 5,6-trans impurity isomer;5.travoprost 15-keto derivative;6.pharmaceutical excipients;7.benzalkonium chloride;8,9.unknown impurity.
2.5.1 曲伏前列素线性关系 取对照品储备溶液适量,加水制成每毫升含曲伏前列素0.022,0.22,4.39,21.93,43.86,109.64及219.29 μg的溶液,按上述色谱条件进行测定,以浓度(
2.5.2 各杂质线性关系 精密量取曲伏前列素杂质A、各杂质对照品储备溶液各1 mL,置同一10 mL量瓶,用水稀释至刻度,摇匀,作为杂质线性实验混合溶液;精密量取上述溶液适量,用水逐步稀释为每毫升含曲伏前列素杂质A、曲伏前列素15-表非对映异构体、曲伏前列素5,6-反式杂质异构体和曲伏前列素15-酮衍生物分别为0.015,0.02,0.02,0.02;0.031,0.04,0.04,0.04;0.155,0.19,0.22,0.20;0.310,0.39,0.44,0.40,1.55,1.93,2.18,1.99;3.10,3.87,4.37,3.98 μg的系列混合溶液,按上述色谱条件进行测定,以浓度(
取同一份供试品溶液,按上述色谱条件连续进样6次,测定峰面积,曲伏前列素峰面积RSD为0.3%(
取对照品溶液,室温条件下放置,分别在0,3,6,9,15,24,36 h按上述色谱条件进样测定,记录峰面积。结果曲伏前列素峰面积RSD为0.2%,表明对照品溶液在室温下放置36 h内稳定。
取“曲伏前列素的线性关系”和“各杂质的线性关系”项下实验溶液逐步稀释,按上述色谱条件进行测定。以信噪比约为10计算定量限;以信噪比约为3计算检出限,结果见表2。
表2 标准曲线、校正因子、检测限和定量限测定结果
Tab.2 Results of standard curve,calibration factor,detection limit and quantification limit
2名工作人员分别在2台不同Waters e2695高效液相色谱仪上,用同品牌同型号不同批次2根Phenomenex LUNA 苯基己基色谱柱(3.0 mm×150 mm,3 μm),不同时间内测定曲伏前列素含量和有关物质,结果2人在12份样品中均只检出曲伏5,6-反式杂质异构体,平均含量0.87%,RSD3.7%;曲伏前列素平均含量105.8%,RSD=0.76%。表明方法重复性良好。
2.10.1 曲伏前列素回收率实验 精密量取对照品储备溶液1.5,2,2.5 mL,每个体积3份,共9份,分置10 mL量瓶,分别加入辅料溶液2 mL,用水稀释至刻度,摇匀,即得回收样品溶液。按上述色谱条件测定,计算回收率。曲伏前列素平均回收率99.7%,RSD=0.60%(
2.10.2 各杂质回收率实验 精密量取曲伏前列素15-表非对映异构体、曲伏前列素15-酮衍生物杂质储备溶液各1 mL,曲伏前列素5,6-反式杂质异构体杂质储备溶液4 mL,曲伏前列素杂质A 1.3 mL,置同一50 mL量瓶,用水稀释至刻度,摇匀,作为杂质回收储备溶液;分别精密量取上述溶液3,5,6 mL,每个体积各3份,共9份,分置10 mL量瓶,分别加入辅料溶液2 mL,对照品溶液2 mL,用水稀释至刻度,摇匀,即得杂质回收样品溶液。按上述色谱条件测定,按外标法以峰面积计算回收率。曲伏前列素杂质A平均回收率97.9%,RSD=2.8%(
在选定的色谱条件下,分别在同品牌同型号不同批次的2根Phenomenex LUNA 苯基己基色谱柱上进行耐用性实验,在同一色谱柱上微调流动相的梯度比例,各杂质及曲伏前列素峰间均能良好分离。
2.12.1 样品含量测定 精密吸取对照品溶液、供试品溶液各100 μL,按上述色谱条件进行测定;按外标法以峰面积计算,即得。测定结果见
2.12.2 有关物质测定 精密量取对照溶液和供试品溶液各100 μL,按上述色谱条件进行测定,以加校正因子的主成分自身对照法计算各杂质含量(除曲伏前列素15-酮衍生物的校正因子为0.8外,其他杂质的校正因子均以1.0计),结果见
图3
样品的有关物质测定色谱图
3.曲伏前列素;4.曲伏前列素5,6-反式杂质异构体;7.苯扎氯铵。
Fig.3
Chromatogram of the related substances of sample
3.travoprost;4.travoprost 5,6-trans impurity isomer;7.benzalkonium chloride.
表3 样品测定结果
Tab.3 Determination rusults of samples %
在C18色谱柱上尝试以缓冲液-乙腈(75:25)为流动相,但在流速2.0 mL · min-1条件下,曲伏前列素90 min内未出峰,因此决定增加乙腈浓度。当以缓冲液-乙腈(60:40)为流动相时,曲伏前列素15-表非对映异构体与曲伏前列素之间分离度达不到要求,而以缓冲液-乙腈(70:30)为流动相时,曲伏前列素15-酮衍生物出峰时间太晚,而且峰形较差;后发现加入一定量甲醇有助于增加曲伏前列素15-表非对映异构体、曲伏前列素及曲伏前列素5,6-反式杂质异构体3成分之间的分离度。随着甲醇浓度增加,曲伏前列素15-表非对映异构体与曲伏前列素分离度显著改善,但曲伏前列素与曲伏前列素5,6-反式杂质异构体分离度减小。经验证,初步确认选择以0.2%磷酸溶液-乙腈-甲醇(60:32:8) 为流动相。
由于在C18色谱柱上保留时间较长,故考虑改用C8色谱柱,以便缩短保留时间。在选定流动相条件下,虽在C8柱上也能有效分离各杂质峰,但实验表明,在C18柱及C8柱上,杂质检测灵敏度达不到要求;后改用Phenomenex LUNA 苯基己基色谱柱,在选定流动相条件下,杂质分离度及检测灵敏度均符合要求。
在C18色谱柱和C8色谱柱上,苯扎氯铵保留时间均在主峰之后。而在苯基己基色谱柱上,其色谱峰在主峰之前,虽对已知杂质的测定不干扰,但由于其色谱峰较宽,对未知杂质的检测会有一定影响,因此考虑加入离子对,使苯扎氯铵保留时间适当延长,从而不干扰曲伏前列素有关物质的测定。实验表明,苯扎氯铵保留时间与庚烷磺酸钠浓度呈正比,随着庚烷磺酸钠浓度增加,苯扎氯铵保留时间延长;而曲伏前列素及其已知杂质的保留时间几乎不变。当庚烷磺酸钠浓度为20 mmol·L-1时,苯扎氯铵保留时间约在主峰保留时间2倍之后,故离子对庚烷磺酸钠溶液浓度选为20 mmol·L-1。为兼顾曲伏前列素杂质A与辅料间分离度和分析时间,选择梯度洗脱。
分别以220,276 nm为检测波长,发现在220 nm波长条件下,各杂质峰及主峰面积均大于276 nm波长,故选择220 nm作为检测波长。
由于所选用色谱柱的内径及填料粒径较小,因此柱压较高;流速为1.0 mL·min-1时,压力处于仪器高压极限,为降低柱压,保护仪器,选择流速为0.5 mL·min-1,柱温40 ℃。
