高效液相色谱法测定长春西汀注射液中维生素C的含量

向东, 汪秋兰, 邓丽, 王文清, 方建国, 熊微

华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部,武汉 430030

XIANG Dong^,, WANG Qiulan, DENG Li, WANG Wenqing, FANG Jianguo, XIONG Wei^,

Department of Pharmacy, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China

作者简介向东(1989-),男,湖北荆州人,在读博士,研究方向:药物分析与中药药理学。电话:027-83624090,E-mail:xd9048@sina.com。

通信作者熊微(1980-),男,湖北武汉人,主管药师,博士,研究方向:药物分析与药物制剂。电话:027-83624090,E-mail:xwpharm@189.cn。

中图分类号: R973.2 文献标识码: B 文章编号: 1004-0781(2016)12-1352-04

摘要:

目的建立测定长春西汀注射液中维生素C含量的高效液相色谱法(HPLC)。方法色谱柱为InertSustain-C₁₈(4.6 mm×250 mm, 5 μm)柱,流动相为乙腈-0.2 mol·L^-1醋酸铵溶液(60:40),流速1.0 mL·min^-1,柱温30 ℃,检测波长280 nm。结果维生素C在2.5~125.0 μg·mL^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系,r=0.999 7,平均回收率为101.61%,RSD=1.18%(n=9)。结论该方法准确、灵敏、重复性好,可用于长春西汀注射液中维生素C的含量测定。

关键词: 维生素C ; 长春西汀 ; 含量测定 ; 色谱法 ; 高效液相

Abstract:

Objective To establish an HPLC method for determining the vitamin C content in the vinpocetine injection. Methods The chromatographic column was the InertSustain-C₁₈ (4.6 mm×250 mm, 5 μm), with the mobile phase of acetonitrile-0.2 mol·L^-1 ammonium acetate solution (60:40), the flow rate was 1 mL·min^-1, the column temperature was 30 ℃, and the detection wavelength was 280 nm. Results The calibration curves of vitamin C showed a good linear relationship over the range of 2.5-125.0 μg·mL^-1, r=0.999 7.The average recovery of vitamin C was 101.61% and RSD was 1.18% (n=9). Conclusion This method is accurate, sensitive, reproducible, and can be used for the determination of the vitamin C content in vinpocetine injection.

Key words: Vitamin C ; Vinpocetine ; Content determination ; Chromatography ; high performance liquid

长春西汀注射液主要用于改善脑梗死、脑出血后遗症及脑动脉硬化症等引发的各种症状,对神经功能缺损及心功能不全具有较好的改善作用^[1-2]。注射液中加入抗氧化剂维生素C起保护长春西汀的作用,是注射剂中的主要辅料。辅料的含量以及降解产物也是影响注射剂安全性和稳定性的重要因素^[3]。因此,为了提高对长春西汀注射液的质量控制,对维生素C含量进行监测十分必要,而笔者目前未见报道。《中华人民共和国药典》采用碘滴定法测定维生素C的含量,其他常规分析方法还有荧光分析法和分光光度法^[4],但并不适用于含有多种抗氧化剂^[5]和其他辅料的注射液,另外,维生素C性质不稳定,给准确测定带来了麻烦。近年来采用高效液相色谱(HPLC)测定水果^[6]、食品^[7]、药品^[8]中维生素C含量的方法应用广泛,该方法具有较高的准确性、精密性和灵敏度,简便快速,适用性好^[9]。本实验建立了高效液相色谱法(HPLC)测定长春西汀注射液中维生素C含量的方法,以增加对长春西汀注射液的质量控制,为注射剂中抗氧化剂维生素C的测定提供一定的参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-10A型高效液相色谱仪(日本岛津公司),包括LC-10AD泵,SPD-10A型检测器;AUW 220D型双量程分析天平(日本岛津公司,感量:0.1或 0.01 mg)。

1.2 试药

维生素C对照品(含量100.0%,批号:100425-201103,中国食品药品检定研究院);长春西汀注射液(武汉华龙制药有限公司生产,规格:2 mL∶20 mg,维生素C含量0.50 mg,批号:1330011,1330012,1330013;规格:2 mL∶10 mg,维生素C含量0.50 mg,批号:1330008,1330009,1330010;规格:5 mL∶30 mg,维生素C含量1.25 mg,批号:1330005,1330006,1330007,3种规格注射剂维生素C的处方浓度:0.25 mg·mL^-1)。乙腈为色谱纯,水为新制多效纯化水,其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性实验

InertSustain C₁₈柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相:乙腈-0.2 mol·L^-1醋酸铵溶液(60:40);检测波长:280 nm;流速:1 mL·min^-1,柱温:30 ℃,进样量:10 μL。维生素C理论板数>2 000,保留时间2.0 min。供试品溶液色谱图中,维生素C峰与其他色谱峰分离度良好。空白对照溶液在维生素C峰相应保留时间处无干扰吸收峰,对含量测定无干扰。见图1。

2.2 溶液的制备

对照品溶液:取维生素C对照品适量,精密称定,加流动相溶解并定量稀释成每毫升中约含25 μg的溶液,摇匀,即得,临用时新制。供试品溶液:取本品(规格:2 mL:10 mg,2 mL:20 mg,5 mL:30 mg)10支,混匀,精密量1 mL于10 mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,即得,临用时新制。空白对照溶液:按长春西汀注射液中各处方比例制备不含维生素C的空白对照样品,再按供试品溶液的方法制备,即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察精密称取维生素C对照品12.50 mg,置于50 mL量瓶中,用流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品贮备液,再精密量取0.1,0.5,1.0,1.5,2.0,5.0 mL,分别置10 mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。分别取各供试品溶液10 μL进样,记录色谱图。以峰面积(A)对浓度(C)作线性回归,得回归方程:A=36 041C+34 228,r=0.999 7,结果表明维生素C在2.5~125.0 μg·mL^-1范围内与峰面积线性关系良好。

2.3.2 检测限与定量限检测取维生素C对照品适量,精密称定,加流动相溶解并定量稀释成每毫升中约含2 μg的溶液,作为定量限储备液;用流动相稀释成不同浓度的溶液,分别取10 μL进样。当信噪比约为10∶1时,维生素C的浓度为0.060 3 μg·mL^-1,因此确定其定量限为0.603 ng。当信噪比约为3∶1时,维生素C的浓度为0.030 1 μg·mL^-1,因此确定其最低检测限为0.301 ng。

2.3.3 稳定性实验取维生素C对照品适量,加流动相溶解并定量稀释成每毫升中约含40 μg的溶液,于室温(20~25 ℃)下避光放置,在1.5 h内每隔10 min进样一次,测定峰面积。另取供试品溶液于室温下避光放置,在4 h内每隔1 h进样一次,测定峰面积。结果表明,维生素C的稳定性较差,对照品溶液于室温(20~25 ℃)条件下避光放置1.5 h后,峰面积的RSD>2.0%,而供试品溶液相同条件放置4 h后,峰面积的RSD>2.0%。因此为了保证测定结果的准确性,本实验中各溶液必须临用新制。

2.3.4 精密度实验精密吸取同一对照品溶液10 μL,注入高效液相色谱仪,重复进样6次。结果峰面积测量值的RSD为1.79%(n=6),表明仪器精密度良好。

2.3.5 重复性实验取本品10支,混合均匀后按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液,分别进样测定。结果维C的百分含量的RSD=1.37%(n=6),表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率实验取本品10支,混合均匀后量取0.5 mL于10 mL量瓶中,按“2.2”项下供试品溶液80%~120%取样量的范围取样,分别加入对照品溶液6,5和4 mL,即平行制备高浓度、中浓度、低浓度供试品溶液各3份,进样测定,计算回收率,总平均回收率为101.61%,RSD为1.18。可见在80%~120%测试浓度的范围内,测定结果的准确度良好。见表1。

图1 4种溶液的高效液相色谱图
A.空白溶剂;B.维生素C对照品;C.空白对照溶液;D.供试品溶液;1.维生素C;2.长春西汀

Fig.1 HPLC chromatograms of four kinds of solutions
A.blank solvent; B.vitamin C reference; C.blank control solution; D. test solution; 1.vitamin C; 2.vinpocetine

原有量	加入量	测得量			回收率/ %
83.51	100.24	186.37	102.61
83.51	100.24	185.26	101.51
83.51	100.24	185.23	101.48
83.51	125.30	213.76	103.95
83.51	125.30	213.99	104.13
83.51	125.30	209.65	100.67
83.51	150.36	235.66	101.19
83.51	150.36	233.49	99.75
83.51	150.36	232.72	99.24

表1 维生素C回收率测定结果

Tab.1 Recovery results of vitamin C

2.4 维生素C含量测定和稳定性实验

取规格2 mL∶10 mg(批号:1330008,1330009,1330010)的3批长春西汀注射液,规格为2 mL∶20 mg(批号:1330011,1330012,1330013)的3批长春西汀注射液,规格为5 mL∶30 mg(批号:1330005,1330006,1330007)的3批长春西汀注射液各10支,混匀,临用新制。按照“2.2”项下方法制备供试品溶液和对照品溶液。照“2.1”项下的色谱条件,按外标法以峰面积计算维生素C和长春西汀的含量,并进行长期加速稳定性实验,取各个规格3批样品的平均值,结果见表2。

表2 稳定性考察中维生素C和长春西汀含量结果
Tab.2 Content determination of vitamin C and vinpocetine in stability testmg·mL^-1

规格与测定物质	加速稳定性
规格与测定物质	0个月	1个月	2个月	3个月	6个月
2 mL:10 mg
维生素C	0.147 6	0.111 2	0.111 4	0.104 5	0.103 7
长春西汀	4.989 6	4.985 5	4.971 7	5.096 5	5.081 7
2 mL:20 mg
维生素C	0.173 9	0.152 0	0.118 5	0.093 3	0.120 4
长春西汀	10.123 1	10.230 7	9.848 2	10.106 9	10.126 5
5 mL:30 mg
维生素C	0.193 1	0.165 5	0.124 6	0.086 2	0.131 8
长春西汀	6.131 6	6.181 8	6.077 6	6.082 9	6.084 5

表2 稳定性考察中维生素C和长春西汀含量结果

Tab.2 Content determination of vitamin C and vinpocetine in stability testmg·mL^-1

维生素的处方浓度为0.25 mg·mL^-1,从图2中可以看出,在最初的含量测定中维生素C浓度范围0.14~0.20 mg·mL^-1之间,说明在灌封过程中已有部分降解,维生素C的稳定性较差。随着加速实验的进行,维生素C的含量不断降低,由于氮气和其他抗氧化剂的存在,降解速度相对较慢,而长春西汀的含量基本保持不变,维生素C起到了很好的抗氧化作用。

图2 维生素C和长春西汀加速实验
A 维生素C含量变化;B长春西汀含量变化

Fig.2 Accelerated test of vitamin C and vinpocetine
A.vitamin C content;B.vinpocetine content

3 讨论

笔者在本实验比较了不同波长、流速、流动相比例和色谱柱对含量测定的影响,以外标法计算维生素C的浓度。在278,280,282 nm 3个波长下,浓度RSD=0.95%;在0.9,1.0,1.1 mL·min^-1 3个流速下,浓度RSD=1.40%;在色谱柱1:Welch Ultimate XB-C₁₈柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),色谱柱2:Shimadzu InertSustain C₁₈柱(4.6 mm×250 mm,5 μm) ,色谱柱3:Agilent Eclipse Plus C₁₈柱(4.6 mm×250 mm,5 μm) 3个色谱柱下,浓度RSD=2.27%;在65:35,60:40,55:45 3个不同流动相比例下,浓度RSD=0.64%。结果表明该方法耐用性好。

维生素C在水溶液中呈互变异构的形式存在,性质不稳定,易被光、氧气、金属离子等氧化,常常作为抗氧化剂用于药品、食品的辅料和添加剂中^[9]。由于注射液中存在其他抗氧化剂和氮气的保护,维生素C的降解相对较慢,但在测定过程中降解较快,因此维C的测定时,溶液必须临用新制,测定时间最好不要超过1 h,否则将导致测定的结果不准确。

本实验为提高长春西汀注射液的质量标准,建立了高效液相色谱法测定注射液中的维生素C含量,该方法准确、灵敏、重复性好,可用于长春西汀注射液中维生素C的含量测定。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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